Следовательно, тот или иной сегмент ДНК определяет, какой белок будет создан в ходе транскрипции, а затем трансляции. Поскольку ДНК передается от родителей детям через яйцеклетку и сперматозоид, каждый из таких сегментов обеспечивает наследственную передачу черт – показателей активности и иных свойств соответствующих белков. Так, ваша способность видеть цвет обеспечивается тремя разными белками, каждый из которых реагирует на свет определенной длины волны и производится в одном из трех типов колбочек в вашей сетчатке. Возникновение отличий хотя бы в одном триплете, кодирующем одну аминокислоту из приблизительно 350 в составе каждого из этих белков, может привести к небольшим, но ощутимым отклонениям в цветовосприятии. В более радикальных случаях, когда полностью теряется участок ДНК, кодирующий тот или иной светочувствительный белок, развивается одна из форм дальтонизма¹.

Можно подумать, что сегменты ДНК, кодирующие белки, мы и называем генами. Это почти, но не совсем так.

Клетки должны не только определять, какой репертуар белков им нужно создавать, но и контролировать, когда и в каком количестве их производить. Некоторые участки ДНК не кодируют белковые последовательности, а влияют на считывание других сегментов механизмами транскрипции и трансляции. Например, белки из класса факторов транскрипции могут прикрепляться к промотору возле начальной точки работы РНК-полимеразы, уменьшая или увеличивая вероятность того, что полимераза займет нужное место и начнет транскрипцию. Мы уже видели такой пример, когда рассматривали рецептор глюкокортикоидных гормонов. Другой вариант: участок ДНК может транскрибироваться в РНК без последующей трансляции в белок, и сама эта РНК способна взаимодействовать с ДНК или с другими РНК, оказывая влияние на синтез белков. РНК участвует в регуляции жизнедеятельности клетки множеством способов, в которых мы начали разбираться совсем недавно и повысили в итоге статус РНК с простого посредника между ДНК и белком до критически важного участника этих молекулярных «переговоров». Так, чувствуя голодание, клетки производят РНК под названием GAS5 (транскрипт 5, специфичный для остановки роста), которая прикрепляется к ДНК-связывающей области глюкокортикоидного рецептора и таким образом препятствует его взаимодействию с мишенью: структурное сходство с ДНК позволяет РНК служить обманкой².

Регуляция процессов, в ходе которых генетическая информация трансформируется в те или иные молекулы, важна не менее, чем сама эта информация, и тоже попадает в определение гена: ген – это отрезок ДНК (за редким вирусным исключением), кодирующий какую-либо наследственную характеристику, обычно соответствующую одному белку или молекуле РНК, и включающий в себя некодирующие регуляторные последовательности. Это громоздкое определение, к тому же постоянно меняющееся, но жизнь и не обязана соответствовать нашему стремлению к простой терминологии. Ситуацию осложняет и то, что термин «ген» по старинке часто трактуют только как белок-кодирующий сегмент ДНК. В этой книге я постараюсь быть максимально точным и понятным. К счастью, вопрос, к которому мы подошли, достаточно прост.

Теперь мы научились читать геномы любых организмов, то есть устанавливать их полные нуклеотидные последовательности. Поскольку мы умеем выявлять промоторные последовательности, которые велят транскрипционной машине начинать работу, и последовательности-терминаторы, приказывающие ее заканчивать, мы можем посчитать число генов в геноме того или иного организма. В бактериальной клетке их несколько тысяч, и каждая бактерия способна конструировать тысячи разных белков. В геноме бактерий, вызывающих туберкулез и холеру, примерно по 4 тысячи генов, около 98 % из которых кодируют белки³. Геном болгарской палочки – подвида Lactobacillus delbrueckii, часто применяемого для превращения молока в йогурт, – содержит менее 2 тысяч белок-кодирующих генов⁴.

В человеческом геноме около 20 тысяч генов, кодирующих белки. Точно установить число так называемых некодирующих генов, производящих нетранслируемые РНК, сложнее, но предполагают, что их примерно столько же⁵. Не спешите, впрочем, задирать перед бактериями нос: наше превосходство нельзя назвать сногсшибательным, если учесть, что при кажущейся колоссальной разнице в сложности организмов разница в фактическом числе наших генов менее чем десятикратная. Более того, нас нельзя назвать особенными даже среди эукариот (организмов, клетки которых хранят свой наследственный материал в окруженном мембраной ядре). Около 20 тысяч белок-кодирующих генов насчитали в геноме домашней лошади, обычной домовой мыши и даже шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis. У некоторых организмов генов меньше. Плодовая мушка Drosophila melanogaster и гриб Schizophyllum commune имеют примерно по 13 тысяч белок-кодирующих генов, а сапсан – около 16 тысяч. У хлебной плесени Neurospora crassa их около 10 тысяч, а у почвенной амебы Dictyostelium discoideum – около 13 тысяч. Однако есть и организмы с гораздо большим числом генов, чем у нас. ДНК крошечной дафнии Daphnia pulex, почти прозрачного ракообразного длиной не более миллиметра, кодирует 31 тысячу белков, и это пока рекорд среди животных с прочитанным геномом. Рис имеет около 30 тысяч белок-кодирующих генов, а кукуруза вообще обошла нас вдвое с почти 40 тысячами генов белков и десятками тысяч некодирующих генов⁶. Иными словами, число генов очень мало говорит нам о сложности организмов и их способностях.

Мы рассматривали ваш геном как базу данных из 20 тысяч белок-кодирующих генов, но это еще и физический объект – последовательность нуклеотидных пар A-T и Ц-Г, которые представляют собой ступеньки винтовой лестницы ДНК, занимающие физическое пространство. Давайте сначала рассмотрим нуклеотиды, а затем – само пространство. Ваш геном состоит примерно из 3 миллиардов спаренных нуклеотидов. Бактериальные геномы куда скромнее и обычно не превышают нескольких миллионов пар нуклеотидов (п. н.). У возбудителей туберкулеза и холеры, например, по 4 миллиона п. н., а у L. delbrueckii – около 2,3 миллиона. Но люди не особо выделяются и по этому параметру. Геном мыши сравним по размеру с вашим, а геном плодовой мушки примерно в 25 раз меньше. Меньше и геном риса: всего около 430 миллионов п. н. (Если это кажется вам странным – ведь у риса же так много генов, – не переживайте, вскоре мы к этому вернемся.) Зато особенно велики геномы саламандр, включающие от 14 до 120 миллиардов п. н. ДНК двоякодышащих рыб состоит из 130 миллиардов п. н., а геном растения Paris japonica – из колоссальных 150 миллиардов, то есть он в 50 раз больше человеческого и, вероятно, может считаться рекордсменом по размеру. Казалось бы, его превосходит геном одноклеточной амебы Polychaos dubium, составленный из 670 миллиардов п. н., но это спорное число, поскольку определялось устаревшими методами. (Я поражен, что никто еще не пересмотрел ДНК этого существа. Если вы читаете эти строки и располагаете свободным временем с секвенатором в придачу – дерзайте!) Как и в случае с числом генов, прямой связи между размером генома и сложностью организма не прослеживается⁷.

Считая гены и оценивая размеры геномов, мы обнаруживаем удивительную вещь. Как мы отметили, у человека 3 миллиарда пар нуклеотидов и около 20 тысяч генов, кодирующих уникальные белки. Размеры белков сильно варьируют, но в среднем человеческий белок содержит примерно 400 аминокислот, каждая из которых определяется тремя нуклеотидами ДНК. Следовательно, для создания 20 тысяч уникальных белков необходимо около 20 000 × 400 × 3 = 24 000 000 п. н. Но в человеческом геноме не 24 миллиона спаренных нуклеотидов, а 3 миллиарда. Этот геном в 100 с лишним раз больше содержащейся в нем белок-кодирующей ДНК! Так сложилось, что мы узнали длину человеческого генома раньше, чем его нуклеотидную последовательность и число генов в нем, и столь малое количество белок-кодирующих генов по сравнению с ожидаемым от генома такого размера стало для нас сюрпризом. У риса разница не столь велика, но все равно достигает порядка. Как правило, бо́льшая часть генома непосредственно не кодирует белки. Что же тогда она делает? Во многом это остается загадкой до сих пор. Некоторые участки генома транскрибируются в РНК, но потом не транслируются в аминокислотные цепочки. К ним относятся, как отмечалось раньше, независимо работающие молекулы РНК, а также сегменты РНК, которые вырезаются в ходе сплайсинга из транскрипта, синтезированного РНК-полимеразой, до его трансляции рибосомой. Впрочем, значительная часть некодирующей ДНК даже не транскрибируется в РНК, но может влиять на считывание генов, например, формируя места вроде промоторов.

Прежде чем углубиться в тему избыточности генома, давайте получше проработаем его физическую сторону. В начале этого раздела мы спросили: «Насколько велик ваш геном?» – и дали биологически точный, но физически неудовлетворительный ответ: в нем 3 миллиарда спаренных нуклеотидов[23]. Но насколько же он большой? Если вытянуть каждую из двух копий вашего генома, содержащихся почти во всех ваших клетках, в одну линию, длина этой линии достигнет метра. Диаметр клеточного ядра, где хранится ДНК, составляет всего несколько микрометров (миллионных долей метра).

Ваши клетки умещают метр ДНК в пространство, которое занимает одну тысячную одной тысячной этой длины. Не удивительно ли это? Такой вопрос, возможно, кажется вам глупым – само собой, удивительно. Однако я могу смотать 50 метров пряжи в клубок диаметром несколько сантиметров, и это никого не удивит. Здесь все упирается в механику – в жесткость ДНК: на что она похожа больше – на пряжу или на сталь? (Надеюсь, вы удивились бы, смотай я 50 метров оплетенного стального кабеля в клубок диаметром несколько сантиметров, даже если бы кабель был не толще нитки.)

Оценка жесткости материалов – отдельная тема, грозящая погрузить нас в глубины материаловедения и отвлечь от биофизики. К счастью, существует концептуально простая модель жесткости полимеров – длинных молекул-цепочек, – которая позволяет нам судить о размере генома. Представьте три отдельные нити разной жесткости, одинаковые по длине при распрямлении, но в свободном состоянии склонные сворачиваться в аморфные клубки.

Интуитивно мы понимаем, что самая расправленная нить, состоящая из протяженных участков плавных изгибов, будет наиболее жесткой (на рисунке она левая). А нить, скрученная туже остальных (правая), скорее всего, окажется самой мягкой.

Давайте оценим протяженность, на которой молекула кажется прямой, – иными словами, то типичное расстояние, которое нам нужно пройти по нити, прежде чем окажемся лицом в другую сторону. Это расстояние тем больше, чем жестче молекула. Представьте, что муравей бежит по сухой макаронине: направление его движения со временем особо не меняется. Для такой макаронины типичная длина прямолинейного участка очень велика. Теперь представьте вареную макаронину, брошенную на стол. Муравей бежит по ней, часто петляя и поворачивая, а следовательно, длина прямых участков в этом случае, вероятно, не превысит и пары сантиметров.

Теперь мысленно разобьем естественно извитую молекулу на прямолинейные участки, длина каждого из которых соответствует типичной протяженности прямых в этой молекуле, и соединим их узлами, случайно задающими направление соседних отрезков (см. рисунок).

У нас получилось то, что физики и математики называют случайным блужданием. Представьте человека, который делает шаги в совершенно случайном направлении: один – на север, другой – на юго-запад, следующий – на северо-запад и так далее. Казалось бы, пытаться предугадать, где случайно блуждающий человек окажется после нескольких шагов, – совершенно пустая затея, ведь направление каждого шага случайно. Спрогнозировать движение отдельного блуждающего действительно невозможно. Но если представить множество случайных блужданий или понаблюдать за множеством случайно блуждающих, средний результат будет вполне определенным: после 25 шагов случайно блуждающий человек окажется в среднем в 5 шагах от исходной точки; после 49 шагов – в 7 шагах; после 100 – в 10; а после N шагов – в числе шагов, равном квадратному корню из N. (Это справедливо как для более привычного людям блуждания в двух измерениях, так и для блуждания в трех измерениях – например, если не шагать, а плавать.)

Случайные блуждания возникают в бесчисленном множестве ситуаций. Экономисты видят их в стремительных взлетах и падениях фондовых рынков. По типу случайных блужданий часто моделируют траектории плавающих бактерий и пути распространения случайных мутаций в популяции. Подобных примеров мы находим все больше и больше. Эти траектории – классический сюжет в обсуждении прогнозируемой случайности, поскольку надежные усредненные характеристики здесь сосуществуют с волей слепого случая. Кроме того, случайные блуждания, которым свойственна странная зависимость пройденного расстояния от количества шагов, позволяют нам познакомиться с масштабированием. Как мы узнаем во второй части книги, физические характеристики не обязательно увеличиваются пропорционально размеру: подобно упомянутому квадратному корню, между ними часто возникают неожиданные зависимости.

Если рассматривать конформацию ДНК абстрактно, в виде случайного блуждания, наш вопрос о жесткости молекулы преобразуется в вопросы о длине «шага» и количестве «шагов». На визуализациях двойная спираль ДНК кажется прямой на отрезке длиной около 100 нанометров (это десятая часть миллионной доли метра). Иными словами, если схематично изобразить молекулу ДНК с помощью отрезков и спросить, какой длины они должны быть, ответом будет 100 нанометров. (В науке прямые участки полимеров, характеризующие гибкость цепи, называются сегментами Куна в честь швейцарского химика Вернера Куна, и их длину можно рассчитывать по математическим формулам.) Для понимания масштаба отмечу, что ширина (диаметр) двойной спирали составляет примерно 2 нанометра, а длина участка, на котором лесенка ДНК совершает полный оборот (длина витка), слегка превышает 3 нанометра, то есть для такой изящной спирали сегмент Куна у ДНК довольно велик.

Итак, мы можем представить 1 метр ДНК в виде 10 миллионов прямых «шагов». Получается, чтобы ответить на вопрос, насколько же большим будет этот метр ДНК, отпущенный в свободное плавание в клеточной среде, нам нужно понять, какое расстояние покроет случайное блуждание из 10 миллионов шагов по 100 нанометров каждый. Простое вычисление даст ответ: около 0,3 миллиметра, или 300 микрометров. (Это квадратный корень из 10 миллионов, или примерно 3000 шагов, умноженные на длину шага в 100 нанометров.) Полученное число гораздо больше, чем диаметр ядра, не превышающий нескольких микрометров, и даже больше, чем диаметр типичной клетки человека, составляющий от 10 до 100 микрометров.

Здесь вы могли бы возразить, что ваш геном – это не единая неразрывная нить, а массив ДНК, разбитый на 23 хромосомы. (Почти все ваши клетки содержат 46 попарно сгруппированных фрагментов каждой из двух копий вашего генома. Есть и исключения: в яйцеклетках и сперматозоидах хранится лишь одна копия, а в эритроцитах млекопитающих и вовсе нет ДНК.) Конечно, фрагментация упрощает задачу пространственной упаковки ДНК, но не настолько: 1-я хромосома человека, крупнейшая из всех, состоит из 249 миллионов п. н., что соответствует длине примерно 8,5 сантиметра и размеру пятна случайного блуждания (по сути, клубка) около 90 микрометров – а это по-прежнему гораздо больше клеточного ядра. Чтобы было легче сопоставить размеры, я изобразил типичную человеческую клетку с ядром внутри и произвольные клубки ДНК метровой и 8,5-сантиметровой (как в 1-й хромосоме) длины.

Вообще-то упаковка ДНК должна нас восхищать – но не из-за длины человеческого генома, а из-за жесткости, делающей ДНК неподатливой для заточения в клетку. Пространство, в которое должна упаковываться молекула, гораздо, гораздо меньше того пространства, которое она заняла бы, плавая свободно в водном мире.

Упаковка ДНК

ДНК внутри ядер наших клеток не предоставлена самой себе, как макаронина или случайный блуждающий, и не утрамбована, как одежда в наскоро собранном чемодане, а изящно и компактно упакована. Значительная часть нашей ДНК намотана на маленькие катушки диаметром около 10 нанометров, состоящие из белков гистонов.

Но 10 нанометров – это существенно меньше, чем сегмент Куна у ДНК, поэтому для наматывания ДНК на катушки прикладывается большая сила, порождаемая главным образом электрическим притяжением между отрицательно заряженной ДНК и положительно заряженной внешней поверхностью гистонов. Расположение положительно заряженных аминокислот соответствует периодичности бороздок двойной спирали, что предельно увеличивает электрические силы. И снова мы наблюдаем самосборку в действии: физические характеристики ДНК и гистонов, особенно их заряд и форма, позволяют им выстраивать четко определенную рабочую структуру. На каждой катушке намотаны около 150 п. н. почти в два витка, длина ДНК между катушками колеблется от 20 до 90 п. н., и за всей этой конструкцией закрепилось выразительное название «бусины на нитке»⁸.

Далее эти бусы укладываются в петли и компактизируются дополнительно. Ученые долгое время пытались вычислить их конечную форму, основываясь на данных экспериментов, в которых, как правило, извлекали ДНК из клеток либо консервировали клетки с помощью фиксаторов. Самая популярная версия предполагала, что ДНК-белковые бусы формируют волокна толщиной 30 нанометров, а затем эти волокна собираются в тяжи диаметром от 120 нанометров. Но недавно ученые под руководством Клоды О'Ши из Института Солка при Калифорнийском университете в Сан-Диего разработали метод маркировки ДНК без повреждения ядер, который позволяет метить ДНК атомами металла, легко различимыми под электронным микроскопом⁹. Этот метод выявил вместо ожидаемых волокон преимущественно свободные цепочки диаметром от 5 до 24 нанометров. Более того, цепочки оказались в разной степени закрученными либо прямыми в зависимости от того, делились клетки или нет. Возможно, упаковка ДНК менее однородна и более динамична, чем считалось ранее.

Виртуозное сворачивание ДНК внутри клеток – больше чем простое интеллектуальное упражнение. Экспрессия генов – транскрипция того или иного участка ДНК в РНК с возможной трансляцией в белки – сильно зависит от упаковки и организации ДНК. Области ДНК, намотанные на гистоновые катушки либо уплотненные как-то иначе, относительно недоступны для механизмов декодирования генетический информации. Один и тот же ген может быть «включен» или «выключен» в зависимости от сложности его обнаружения. Иными словами, упаковка ДНК влияет на ее функции, и физическая организация этой молекулы служит мощным инструментом регулирования деятельности клетки. Широчайший спектр заболеваний – от нарушений нервно-психического развития и редких аутоиммунных болезней до расщепления нёба – обусловлен некорректной упаковкой ДНК¹⁰, а вовсе не изъянами в генах, кодирующих важные для нервной системы, иммунитета или скелета белки. Часто подобные нарушения связаны с дефектами белков, которые модифицируют гистоны[24], повышая или понижая их аффинность друг к другу или к ДНК – например, за счет изменения заряда.

В последние два десятилетия ученые выяснили, что факторы, определяющие, какие области генома наматываются на гистоны, заложены в самой последовательности ДНК и отчасти обусловлены механическими свойствами двойной спирали¹¹. Как мы знаем, длина относительно прямых сегментов ДНК составляет около 100 нанометров. Показатель жесткости в некоторой степени зависит от последовательности нуклеотидов, то есть «букв» A, Ц, Г, T. Одни группы нуклеотидов обладают меньшей жесткостью, чем другие, или в силу своей формы склоняют цепь к легкому изгибу. В той ДНК, которая в итоге оказывается в составе нуклеосом[25], эти более изогнутые или гибкие области, как маленькие шарниры, обычно располагаются через 10 нуклеотидов друг от друга. Длина витка двойной спирали тоже составляет 10 нуклеотидов: поднимись вы по винтовой лестнице ДНК на 10 ступенек, окажетесь лицом в ту же сторону, что и в исходной точке. Это значит, что все шарниры ориентированы в одном направлении и каждый фрагмент ДНК загибается к гистонной катушке. Анализ связывания ДНК с гистонами показывает, что последовательности без таких повторяющихся нуклеотидных пар реже оказываются намотанными. Таким образом, сама нуклеотидная последовательность кодирует механическую информацию о том, как именно она должна быть упакована. ДНК – молекула поистине экстраординарная, искусно совмещающая кодирование и механической, и биохимической, и генетической информации!

Архитектура нуклеосом и волокон ДНК вводит нас в обширную тему регуляторных схем, с помощью которых клетки контролируют свою активность, включая и выключая гены. В четвертой главе мы познакомимся с другими стратегиями принятия решений, реализуемыми по более быстрым и сложным схемам.

Вирусы, набитые ДНК

Задачу по ужатию ДНК в ограниченном пространстве решают не только ваши клетки. Ни один из живых организмов не позволяет ДНК свободно укладываться в виде случайно блуждающей цепи. Это актуально даже для не совсем живой природы: плотнее всего ДНК упакована в вирусах, маленьких капсулах генетического материала, которые заражают живые клетки и завладевают их механизмами репликации. Не все вирусы содержат двухнитевую ДНК, у некоторых геном представлен однонитевой ДНК либо даже одно– или двухнитевой РНК. Обладатели двухнитевой ДНК, к которым относятся вирусы герпеса и оспы, вынуждены упаковывать эту жесткую молекулу в белковую оболочку (капсид) диаметром всего несколько десятков нанометров, что опять же меньше сегмента Куна для двойной спирали ДНК. (Двухнитевая РНК даже жестче двухнитевой ДНК, а вот одиночные нити что ДНК, что РНК куда более гибкие.)

У вируса с двухцепочечной ДНК изогнутый, стиснутый полимер давит на капсид, пытаясь расправиться. Когда капсид открывается – например, в момент заражения клетки, – это внутреннее давление помогает протолкнуть ДНК в клетку-мишень. Можно ли измерить давление сжатой ДНК? Представьте, как закрытый капсид открывается и ДНК вырывается наружу. Теперь представьте, как капсид сжимается со всех сторон под внешним давлением и затем открывается. Если наружное давление меньше внутреннего, ДНК все равно выйдет наружу. Если же наружное давление больше, ДНК останется внутри. Изменяя внешнее давление и наблюдая, выходит ли при этом ДНК, можно определить давление внутри вирусной частицы (вириона).

Представить описанное несложно, однако на практике не обойтись без хитроумных трюков, один из которых около 15 лет назад применила команда Уильяма Гелбарта из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Естественное открытие капсида запускается, когда вирус встречается с особыми белками на поверхности клетки-мишени. Добавляя эти белки в пробирку с вирусными частицами, открывать капсиды можно «по требованию». Вирионы рассеяны в водном растворе. При добавлении в раствор крупных молекул растет осмотическое давление: это несколько напоминает бомбардировку вируса всеми молекулами, плавающими вокруг него, и действует на него, как то гипотетическое сжатие капсидов. Изменяя осмотическое давление и открывая капсиды с помощью белков, ученые зафиксировали внутри вирусов давление в десятки атмосфер¹². (Для сравнения: давление воздуха в автомобильной шине составляет около двух атмосфер.) Чтобы лучше прочувствовать масштаб механического подвига вирусов, биофизик Роб Филлипс советует представить, как почти 500 метров стального троса с моста Золотые Ворота заталкивают в кузов фургона FedEx. Такое гигантское внутреннее давление полезно для вируса тем, что помогает ему внедрять ДНК в клетки-мишени, где она реплицируется и запустит производство новых вирусов.

Невозможно постичь ДНК, не разобравшись в ее физических характеристиках. Форма, структура и механика неразрывно связаны с биологической функцией. Это утверждение верно не только для ДНК, но и для всех биомолекул в природе – биофизика постоянно имеет дело с такими зависимостями. В следующей главе мы вернемся к вопросу о том, как удивительно малое число генов может управлять процессами, которые делают вас вами, и узнаем, как гены включаются и выключаются – под действием внешних факторов или других генов, – создавая сеть взаимодействий, опять же неотделимую от осязаемых, физических проявлений молекул жизни.

Как мы знаем, ДНК и белки – это физические тела со специфической структурой, которая определяет характер их работы. Lac-репрессор связывается с ДНК поразительно хитроумным способом. Расстояние между последовательностями нуклеотидов, которые он распознает, превышает его собственную ширину. Следовательно, репрессор должен сворачивать ДНК в тугое кольцо диаметром около 10 нанометров².

Мы помним, однако, что ДНК – молекула жесткая. Если дать ей свободу, она останется относительно прямой на 100-нанометровых отрезках. Подобно цирковому силачу, гнущему железный прут, lac-репрессор изгибает ДНК. Свернутая в петлю ДНК мешает РНК-полимеразе считывать гены белков, которые участвуют в расщеплении лактозы³.

У lac-репрессора есть еще одно удивительное свойство: он может связываться с молекулярным двойником лактозы, аллолактозой (черный кружок на следующем рисунке), из-за чего слегка меняет форму и теряет способность удерживаться на операторе. Набредая на лактозу в среде, бактерия поглощает какое-то ее количество и преобразует в аллолактозу, lac-репрессор перестает работать, и синтезируются расщепляющие лактозу белки – теперь бактерия может насытиться находкой.

Регуляторы, подобные lac-репрессору, характерны для всех организмов, не только для бактерий. Мешать РНК-полимеразе должным образом взаимодействовать с ДНК или хотя бы конкурентной борьбой снижать вероятность такого взаимодействия – одна из излюбленных природой тактик регуляции активности генов. Подавление экспрессии может быть сопряжено с внешними стимулами, как в случае с lac-репрессором, либо с внутренними, как мы увидим далее.

В регуляторном арсенале клетки припасены и противоположно действующие инструменты – активирующие экспрессию. Особенно часто они работают в районе промоторов, с которыми РНК-полимераза связывается слабо. Белки-активаторы, имеющие сродство с полимеразой, распознают и занимают прилегающие к промотору участки ДНК, повышая шансы РНК-полимеразы удержаться и начать транскрипцию.

Активаторам нашлось место и в истории с лактозой. Бактерии вроде E. coli действительно любят лактозу, но еще больше они любят другой сахар, глюкозу. Будь у бактерий глюкоза, они ни за что не стали бы тратить силы на расщепление даже доступной лактозы. Этот феномен в 1940-х открыл Жак Моно⁴, который во время Второй мировой войны совмещал исследования в области фундаментальной биологии с участием во французском Сопротивлении. Бактерия должна экспрессировать гены расщепления лактозы, только если в среде есть лактоза и нет глюкозы. Задачу регулятора здесь выполняет белок, активирующий катаболизм (CAP; г-образная фигура на рисунке). Связь РНК-полимеразы с lac-промотором слаба, поэтому даже без lac-репрессора транскрипция генов катаболизма лактозы маловероятна. Бактерия производит белок-активатор, который садится на ДНК, только если связан с молекулой под названием циклический аденозинмонофосфат, или цАМФ. Эту молекулу бактерии производят лишь при низком уровне глюкозы, и ее даже называют «сигналом голода». Следовательно, в присутствии глюкозы цАМФ мало, активатор не связывается с ДНК, и гены расщепления лактозы не экспрессируются, даже если она доступна. Когда глюкозы нет, цАМФ много, активатор связывается с ДНК и гены экспрессируются – при условии, что полимераза не блокируется lac-репрессором. Это очень хитроумная система, особенно для безмозглого существа размером в тысячную долю миллиметра.

Репрессоры и активаторы в совокупности называют факторами транскрипции, поскольку они управляют транскрипцией генетической информации. Факторы транскрипции представляют собой белки, а значит, сами кодируются генами. В нашем геноме таких генов очень много – точное число неизвестно, но считается, что их не меньше 1600⁵. И это при том, что у нас всего около 20 тысяч белок-кодирующих генов. Иными словами, существенная часть наших генетических инструкций приходится на тормозящие и инициирующие механизмы считывания самих инструкций.

Факторы транскрипции и решения, которые они обеспечивают, характерны для всей живой природы и незаменимы при кодировании сложного поведения простыми генами. Регуляторным областям – посадочным площадкам для факторов транскрипции в геноме – даже не обязательно примыкать к подконтрольным генам. Поскольку геном изгибается и перекручивается, транскрипционный фактор, связанный с участком ДНК, может влиять на экспрессию гена, который пространственно приближен, хотя на распрямленной ДНК находился бы далеко (см. рисунок)⁶.

Такие взаимоотношения генетического и физического расстояний открывают дополнительные возможности для регуляции генов и активно исследуются в современной биофизике.

Все механизмы, которые мы рассматривали, относились к регуляции транскрипции, то есть первого шага в экспрессии гена, когда закодированная в ДНК информация переписывается языком РНК. Клетки также могут регулировать трансляцию, или синтез белка по матрице РНК. Способов такой регуляции множество, включая управление скоростью деградации матричной РНК, изоляцию мРНК в особых зонах клетки и даже синтез молекул РНК, комплементарных мРНК, чтобы образовавшийся дуплекс не смог транслироваться в белок. Мы могли бы посвятить еще множество страниц изучению разнообразия инструментов генетической регуляции, но лучше сделаем шаг назад и оценим универсальность этих механизмов и некоторых структур, созданных природой для объединения отдельных инструментов в машины.

Портативный генетический контроль

Мы увидели, как lac-система применяет факторы транскрипции, чтобы включать или выключать гены в зависимости от стимулов окружающей среды, в частности от актуального выбора сахаров. E. coli и другие бактерии используют эту систему, чтобы привести свою биохимическую активность в соответствие с доступностью той или иной пищи. Ученый может без труда добавить лактозу в колбу с изголодавшимися по глюкозе бактериями, и это подтолкнет их к активации гена lacZ. Однако можно поступить похитрее, добавив в колбу реагент ИПТГ, который очень похож на аллолактозу, но при этом устойчив к расщеплению. Связавшись с ИПТГ, lac-репрессор не сможет удерживаться на операторе и подавлять транскрипцию, поэтому клетка начнет производить ферменты катаболизма лактозы, даже когда ее нет. Смысл этих странных манипуляций в том, чтобы создать управляемую систему для экспрессии нужных генов. Возможно, ученый заменил гены расщепления лактозы другими, сохранив те же регуляторные элементы, включая lac-промотор. Эти новые гены могут кодировать флуоресцентные белки, позволяющие наблюдать за бактерией, или какие-то полезные вещества вплоть до лекарств. Теперь ученый может контролировать экспрессию встроенных генов с помощью внешнего индуктора, ИПТГ.

Поразительный пример такого генетического контроля описан Хайди Скрабл и ее коллегами из Университета Вирджинии в статье 2001 года с бесхитростным названием «Система lac-оператор – lac-репрессор работает у мыши»⁷. Ученые использовали мышей-альбиносов с мутантным геном тирозиназы, необходимой для производства пигмента. Внедряя в мышиную ДНК рабочий ген тирозиназы и его промотор (см. рисунок), авторы получали животных с типичной для вида пигментацией – с коричневой шерстью и карими глазами. Одной из любопытнейших частей эксперимента была организация управления генами пигментации. Хотя у животных немало регуляторных систем, свойственной бактериям lac-системы они лишены. Тем не менее ученые создали мышь с сайтом связывания lac-репрессора между промотором и кодирующей частью гена тирозиназы. Поскольку у млекопитающих нет гена lac-репрессора, а значит, и белка, синтез тирозиназы не подавлялся, и пигментация у таких мышей оказывалась нормальной (второй ряд на рисунке).

Другой линии мышей, тоже несущей ген тирозиназы под контролем lac-оператора, внедрили и ген lac-репрессора с собственным промотором. Эти мыши производили белок-репрессор (темная фигура), подавлявший экспрессию гена тирозиназы и лишавший их пигментации (третий ряд). Когда таких мышей поили водой с примесью ИПТГ, у них появлялась коричневая окраска (четвертый ряд). Как и в случае с бактериями, ИПТГ не позволял lac-репрессору блокировать считывание зависимого гена.

Наряду с нашей почти непостижимой способностью менять цвет шерсти и глаз животного с помощью сахароподобной молекулы в питьевой воде, этот эксперимент подчеркнул универсальность механизмов жизни. Последний общий предок мышей и бактерий сгинул более 3 миллиардов лет назад. С тех пор эволюция его потомков шла разными путями, выдав нам два непохожих существа: одноклеточный микроорганизм и мохнатого зверька размером с ладонь. Тем не менее, если вставить регуляторный аппарат одного из них в геном другого, он работает без нареканий[27]. Как за полвека до этого прозорливо и емко отметил сам Моно, «что истинно для E. coli, истинно и для слонов»[28].

Помимо lac-системы существует множество других, позволяющих организмам – или ученым – регулировать экспрессию генов. Подобные конструкции в ходу и в моей лаборатории. Только мы не меняем цвет мышиной шерсти, а включаем и отключаем способность некоторых бактерий плавать: добавляя в воду простой реагент, мы побуждаем их собирать или разбирать свои микроскопические моторы. Этот инструмент дает нам возможность оценить, насколько плавание помогает бактериям преуспевать в их среде. Всего за несколько десятилетий такая работа перетекла из области научной фантастики в реальность и продолжает упрощаться дальше.

Генетическая память

Если вы нажмете на выключатель, чтобы зажечь свет, вам не нужно будет удерживать палец на кнопке, чтобы лампа не погасла. Выключатель зафиксируется в новом стабильном положении и останется в нем, пока его не зафиксируют в другом, тоже стабильном. Природа и ученые тоже часто прибегают к подобным рубильникам: они направляют клетки на определенный путь при получении сигнала и не дают им свернуть с него, даже если сигнал пропал. У растений и животных это особенно важно для развития клеток разных типов. Так, и нейроны, и глия, которая помогает нейронам функционировать, берут начало от общей клетки-предшественницы. Специфические сигналы направляют ее на путь формирования нейрона, после чего она обречена экспрессировать соответствующий набор генов, создавать синапсы с другими клетками и выполнять все остальные задачи, возложенные на нейрон. Наверняка вам не хотелось бы постоянно уведомлять нейрон, что не стоит ему возвращаться к предковой форме, равно как и обращаться в глию либо нейронно-глиальную несуразицу. Чтобы тип клетки не менялся, генам нужны тумблеры. Иными словами, клеткам нужна память: они должны запоминать воспринятые когда-то стимулы, перекодируя их в схемы экспрессии генов, стабильные в настоящем и будущем.

Способов создать воспоминание много. Есть и такой, который основан на знакомом нам действии факторов транскрипции. Представьте два гена, A и B. Как и в случае с lac, у гена А есть репрессор. Теперь допустим, что ген этого репрессора находится сразу за геном B по ходу транскрипции, поэтому, если экспрессируется B, то экспрессируется и он. Представьте, что ниже A по ходу транскрипции, подобно гену репрессора А, находится ген репрессора B, и если экспрессируется А, экспрессируется и этот ген. Такая взаимная репрессия обеспечивает работу памяти. Допустим, A экспрессируется сильно. Клетка производит много репрессора гена B, поэтому B подавляется, в отличие от А (репрессор гена А не считывается из-за совместной с В репрессии), что соответствует сильной экспрессии А. Клетка продолжает существовать в состоянии А. С другой стороны, если сильно экспрессируется B, события развиваются противоположным образом и клетка продолжает существовать в состоянии B. У этой клетки два стабильных типа поведения. Мы можем переключиться между ними, например, наводнив клетку множеством сигналов активации или репрессии какого-то из этих генов. Если в регуляторном аппарате задействован lac-репрессор, то таким сигналом может быть ИПТГ. С этого момента клетка будет хранить воспоминание о произошедшем событии.

Здесь проиллюстрирован общий принцип, который заключается в том, что гены регулируют экспрессию генов. Иными словами, обратная связь между генами формирует те или иные паттерны активности. В нашем примере тумблером служили два варианта репрессии (отрицательная обратная связь). И это не гипотетическая история: такая схема часто работает в живой природе: например, заразившие бактерию вирусы вынуждены выбирать между состояниями активного размножения и «спячки». Но немало и других эффективных схем. Мы можем, например, совместно экспрессировать ген А и ген его активатора, усиливая результат стимуляции, изначально направившей клетку на путь А (положительная обратная связь).

Часы и схемы

Мы узнаем время по часам. В основе конструкции любых часов лежит какой-то периодический, ритмический феномен вроде колебаний маятника или частых вибраций кварцевого кристалла. Все живые организмы и даже отдельные клетки используют часы, чтобы контролировать активность, которая должна усиливаться и ослабевать с определенной периодичностью. Прекрасный пример – циркадные ритмы⁸. У многих растений выработка хлорофилла организована примерно в 24-часовом цикле, что соответствует длительности суток. Растение ориентируется не только на внешние сигналы, которые непостоянны из-за теней и облаков, но и на внутренний механизм отсчета времени с 24-часовым периодом. Он есть и у людей: температура тела, кровяное давление и, разумеется, сонливость повышаются и снижаются у вас примерно раз в сутки, даже если вы неделями сидите в комнате с неизменной освещенностью. Циркадные часы есть у животных, грибов и даже некоторых бактерий. Восприятие света помогает поддерживать ритм и сдвигает моменты пиков и минимумов, но сама периодичность обусловлена внутренними осцилляторами.

Регуляция активности генов позволяет отдельной клетке создать осциллятор исключительно из ее собственных компонентов. Здесь мы вынуждены уйти в некоторую абстракцию, поскольку реальные клеточные осцилляторы устроены сложно и задействуют множество генов. Для иллюстрации общего принципа можно обойтись и одним.

Простейший осциллятор состоит из гена, который репрессирует сам себя, – точнее, гена, кодирующего белок, который подавляет экспрессию своего же гена. На первый взгляд это кажется нелепым: как такой ген вообще будет работать? Разгадка здесь в том, что и на экспрессию, и на репрессию нужно время. Как мы помним, экспрессия гена предполагает транскрипцию участка ДНК в молекулу РНК, а затем (для белок-кодирующих генов) трансляцию этой РНК в цепочку аминокислот – белок. Если формируется белок-репрессор, то ему предстоит какое-то время поблуждать, прежде чем он наткнется на промоторную область подавляемого гена. Даже после того, как репрессор свяжется с ДНК и блокирует работу РНК-полимеразы, ген инактивируется не сразу. Уже произведенные копии РНК могут и дальше транслироваться, а синтезированные белки могут и дальше заниматься своими делами. Суть в том, что экспрессия может какое-то время нарастать, и ген еще остается активным, хотя и репрессирует сам себя. Чтобы лучше понять, как колеблется его активность, нам нужно привлечь еще один факт о белках: все белки со временем деградируют, то есть разрушаются.

Распад факторов транскрипции сильно влияет на генетическую регуляцию. Фундаментальная истина физики молекулярного взаимодействия состоит в том, что повышение концентрации молекул – например, нашего репрессора – приводит к повышению вероятности их связывания с чем-либо, к чему у них есть сродство, – например, с нашим промотором. Верно и обратное: когда свободные белки-репрессоры деградируют и их концентрация снижается, растет вероятность того, что связанных с ДНК репрессоров будет все меньше и они перестанут подавлять транскрипцию. Тогда ген сможет экспрессироваться.

Сложив все факты воедино, получим вот что. В нашей схеме ген изначально экспрессировался, медленно наращивая концентрацию собственных белков-репрессоров и подавляя тем самым дальнейший их синтез. Но готовые белки деградируют, и в конце концов их остается так мало, что экспрессия гена возобновляется – начинается новый цикл. Так мы получаем простейший осциллятор.

Впрочем, этот осциллятор не слишком хорош, и мне не известен ни один организм, который пользуется часами на базе единственного гена. Настроить хронометраж в такой системе очень сложно, и ее периодичность не будет точна. Оба свойства зависят от скорости деградации белков, которая в клетке определяется множеством факторов за рамками полномочий этого гена и его саморепрессии.

В более удачном механизме работают три гена – A, B и C: A репрессирует B, B репрессирует C, а C репрессирует А. Я не стану описывать схему детально, но она тоже осциллирующая. Количество каждого из белков периодически увеличивается и уменьшается. Частота колебаний зависит от сродства репрессоров к ДНК. Мы или клетки способны настраивать периодичность циклов с помощью репрессоров, которые сильнее или слабее связываются с ДНК. В природе эта схема A-B-C, называемая репрессилятором, как обособленная единица не встречается, зато ее одной из первых искусственно ввели в живые клетки и проверили: к началу XXI века с этой задачей справились биофизики Майкл Эловиц и Станислас Лейблер⁹. Ученые внедрили такой осциллятор в геном бактерии E. coli и сопрягли его с геном зеленого флуоресцентного белка, получив в результате клетки, которые ритмично переключались между флуоресцирующим и обычным состояниями. С тех пор в клетках испробовали множество других точных и тонко настраиваемых осцилляторов¹⁰.

Хотя автономного природного репрессилятора пока не нашли, в составе разных регуляторных аппаратов подобные схемы встречаются часто. Так, 24-часовой осциллятор, контролирующий циркадный ритм человека, состоит из нескольких генов, связанных пересекающимися петлями обратной связи, в том числе репрессиляторного типа. Часы на основе такого механизма отличаются надежностью, но при этом поддаются обучению с помощью внешних стимулов вроде солнечного света, провоцирующих химические изменения в нашем организме. Обучение происходит не сразу – об этом вам скажет любой, кто испытывал джетлаг[29]. Порой нам хочется перевести свои часы быстрее, чем позволяет организм. Но наш циркадный ритм сформировался в мире, где не было высокоскоростных воздушных путешествий.

Регуляторные инструменты не ограничиваются созданием генетической памяти и осцилляторов, они способны выстраивать бесчисленное множество вариантов межгенных взаимодействий. Представьте абстрактное трио генов A-B-C, в котором и A, и B кодируют активаторы гена C. Если не синтезируется ни один из активаторов, экспрессия С будет слабой. Она резко возрастет, если появятся индукторы экспрессии A или B. Можно сконструировать набор генов, который активирует C только при индукции экспрессии A и B либо А, но не B и так далее. (Мы даже встречали пример последней конфигурации – у бактерий, экспрессирующих lacZ, когда поглощают лактозу, но не глюкозу.)

Устройство, способное производить логические вычисления на основе входящих сигналов – принимать решения, обрабатывая операторы типа «и», «или», «не» и их комбинации, – это компьютер. Привычные нам компьютеры ориентируются на электрическое напряжение – есть оно или нет, высокое оно или низкое, – а не на биохимические факторы транскрипции, но концептуально эти типы вычислительных машин не различаются. Более того, они работают на основе общих принципов. Подходящая комбинация логических элементов – хоть электрических сигналов, хоть генов – позволяет выполнять любые вычислительные операции, будь то сжатие цифрового видеофайла или оценка условий для прорастания семени.

Логика и память позволяют природе строить всевозможные генетические схемы для решения всевозможных задач. Следовательно, гены способны определять гораздо более сложную деятельность, чем можно предполагать, исходя из простого их подсчета.

Гены на чердаке

Еще один способ контролировать экспрессию генов основан на уже знакомом нам феномене – упаковке ДНК. Как мы узнали, от расположения гена относительно нуклеосом зависит, насколько сложно РНК-полимеразе его считывать. В последние десятилетия мы сумели оценить по достоинству всю мощь генетической регуляции, связанной с упаковкой ДНК. Инструменты модификации белков присоединяют к гистонам определенные наборы атомов или, наоборот, удаляют их, оказывая влияние на способность гистонов формировать с ДНК плотные волокна. Модификация гистонов особенно важна на ранних стадиях развития зародыша, когда потомки нескольких клеток навсегда обретают уникальную клеточную идентичность, а также в канцерогенезе, когда клетки переходят к стремительному делению и миграции¹¹. Гены, невостребованные тем или иным типом клеток, остаются плотно упакованными, будто заваленными на чердаке: они никуда не пропадают, но доступ к ним затруднен.

Клетки также могут контролировать доступность генома для прочтения, химически изменяя саму ДНК. Так, особые ферменты способны заменять атом водорода в нуклеотидах A и Ц на атом углерода с тремя атомами водорода, то есть на метильную группу. Метилирование нуклеотидов в составе гена может подавлять его экспрессию. Эта крошечная метка на ДНК способна застопоривать транскрипционную машину и привлекать белки – модификаторы гистонов.

Как ни удивительно, эти элементы генетической регуляции – упаковка и метилирование ДНК, – похоже, могут передаваться от родителей детям. Очевидно, мы наследуем не только характерную последовательность «букв» генома, но и некоторые элементы его организации, влияющие на интерпретацию генетической информации. Этот феномен, называемый эпигенетикой¹², придает дополнительный уровень сложности связям между нашей генетической компонентой, окружающей средой и работой нашего организма. Например, у голландцев, переживших «голодную зиму» 1944–1945 годов, в дальнейшем фиксировали повышенную предрасположенность к ожирению и сердечно-сосудистым заболеваниям, при этом десятилетиями у них сохранялась измененной картина метилирования ДНК. Более того, подобные маркеры проблем со здоровьем находили и у их детей, родившихся гораздо позже голодных времен, что указывает на наследование эпигенетических модификаций генома¹³.

В завершение этой главы напомним себе, что аппарат генетической регуляции превращает любой организм в мощный многозадачный компьютер, способный принимать решения на базе разнородных стимулов из окружающей среды и выстраивать поведение, изменяющееся во времени и пространстве. Вся эта сложность, однако, не нуждается в центральном управлении или обдумывании, а проистекает из самой природы генетического материала, заключающего в себе как гены, так и средства их регуляции. И снова мы наблюдаем самосборку в действии: механизмы конструируют сами себя. Изящество генетических схем и предсказуемость в принятии решений, однако, сосуществуют со случайностью, пронизывающей весь микроскопический уровень организации. Прежде чем в шестой главе мы оценим ее значимость, познакомимся еще с одним важным клеточным компонентом – мембранами: их архитектура служит великолепным примером самосборки, независимой от белков и ДНК.

Масло и вода не смешиваются. Если взболтать бутылку с уксусной салатной заправкой, масло быстро соберется в капельки. Предоставленные сами себе, молекулы масла держатся других молекул масла, а молекулы воды – других молекул воды. Как мы узнали из второй главы, вещества вроде масел и жиров, которые отделяются от воды, называются гидрофобными («боящимися воды»), а вещества вроде сахара и уксуса, которые смешиваются с водой, – гидрофильными («любящими воду»).

Липиды и гидрофобны, и гидрофильны. У каждой молекулы липида есть «головка», которая любит воду, и «хвост», которому вода не нравится. Хвост обычно состоит из двух цепочек, химически схожих с молекулами масла[31]. Есть и другие знакомые вам вещества с такими амфифильными наклонностями («любящие и то, и другое»): каждая молекула мыла состоит из гидрофильной головки и гидрофобной хвостовой цепочки – вместе они позволяют мылу цепляться и за жирную грязь, и за воду, которая ее смывает.

Липиды в воде страдают от противоречия, обусловленного их строением: их головки счастливы, а хвосты – нет. Чтобы защитить свои хвосты от воды, молекулы липидов головками наружу спонтанно объединяются в двуслойную листовую структуру. Такой липидный бислой формирует основу всех клеточных мембран.

Липидные мембраны обладают примечательными физическими свойствами. По сути, они двумерны: толщина бислоя приближается к 5 нанометрам (то есть он примерно в 20 тысяч раз тоньше обычного листа бумаги), при этом его протяженность может во много тысяч раз превышать толщину. Мембраны пластичны и способны изгибаться в трех измерениях, причем клетки тщательно контролируют их кривизну.

Мембрана может напомнить вам полиэтиленовый пакет: она такая же тонкая и гибкая. Но между ними есть важное различие. Если маркером поставить точку на пакете, отвернуться и снова посмотреть на него через несколько минут, точка останется на прежнем месте. Если проделать то же самое с липидной мембраной, точка расплывется, а затем исчезнет: помеченные молекулы просто разбредутся по мембране. Липидные бислои и клеточные мембраны в целом – это двумерные жидкости. Подобно тому как молекулы воды в жидкости плавают, не зафиксированные друг относительно друга, липиды и белки перемещаются в пределах мембраны. Эта мобильность, как и другие важные физические свойства мембран, обусловлена природой бислоя: липиды не жестко сцеплены друг с другом, а просто объединяются, чтобы оберегать свои гидрофобные части от воды. Ничто не мешает молекулам петлять между соседками, пока гидрофобная сердцевина бислоя не вступает в контакт с водой.

Молекулярная мобильность – удивительная черта: компоненты мембраны могут перегруппировываться, взаимодействовать друг с другом и даже формировать характерные структуры, помогающие клеткам выполнять разные задачи.

Поразительный пример этого можно наблюдать в вашей иммунной системе, когда Т-клетки взаимодействуют с антигенпредставляющими клетками (АПК)². АПК захватывают белки из своего окружения, нарезают их и выставляют фрагменты напоказ, прикрепляя их к своим мембранным белкам, торчащим над клеточной поверхностью[32]. Т-лимфоциты встречаются с АПК, вступают в контакт и изучают представленные им фрагменты, чтобы определить, нормальные ли это молекулы вашего организма или части кого-то чужого, например бактерии или вируса. Во втором случае Т-клетки активируют вашу иммунную систему, подталкивая защитные механизмы к борьбе с очевидным вторжением. Такая реакция на фрагменты чужеродных белков предполагает динамичный молекулярный танец в зоне контакта Т– и АП-клеток: адгезивные белки их мембран связываются друг с другом и начинают сбиваться в группу.

Вокруг них постепенно группируются другие белки – выставляющие или распознающие фрагменты, то есть участвующие в межклеточной сигнализации. Если представить, что взаимодействие двух клеток происходит в плоскости этого листа, то начальная расстановка белков будет выглядеть так, как показано на рисунке слева (адгезивные белки там темные, а сигнальные – светлые). Через несколько минут эта «мишень» инвертируется: сотни сигнальных белков стекутся к центру, а адгезивные окружат их кольцом (правая расстановка).

Эту структуру – иммунологический синапс – обнаружили в середине 1990-х и с тех пор активно изучали, как формируются такие пространственные паттерны и как Т-клетка транслирует их в сигнал собственной активации. Кроме того, ученые обнаружили подобные синапсы и в зонах контакта между иммунными клетками, передающими вирус Т-клеточного лейкоза человека (Т-лимфотропный вирус) либо вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, который вызывает СПИД)³. Очевидно, эти вирусы научились взламывать структурообразующий механизм клеток, которые они заражают. Не вдаваясь в тонкости формирования синапсов, отметим лишь, что если бы они не находились в двумерной жидкости, то сигнальные и адгезивные белки Т-лимфоцитов и многие другие мембранные белки прочих клеток не могли бы выполнять динамичные пространственные перестроения, которые требует от них природа.

Белковые и липидные паттерны связаны и с темой предсказуемой случайности. Текучесть мембран позволяет их компонентам перегруппировываться, но привносит факторы неопределенности потока и неупорядоченности. Ни человек, ни клетка не способны знать наперед, где именно окажется каждый липид или белок, но мы можем прогнозировать усредненно свойства целого ансамбля. Глубинную природу случайности и смысл предсказаний прояснит нам шестая глава.

Конусы, сферы и пузыри

Бислой – не единственная структура, которую могут создавать амфифильные молекулы. Представьте молекулу в форме рожка с мороженым, где шарик мороженого – гидрофильная часть, а палочка – гидрофобная (слева на рисунке). В воде такие молекулы самостоятельно соберутся в сферу, чтобы защитить свои гидрофобные части (справа).

Форма молекулы – ключевой определяющий фактор в самосборке. Большинство липидов в вашем организме скорее цилиндрические, чем конические – их гидрофильные головки и гидрофобные хвосты сопоставимы по ширине, – как раз потому они и группируются в относительно плоский бислой. И все же у небольшой доли клеточных липидов форма отличается от цилиндрической – не настолько, чтобы воспрепятствовать образованию бислоя, но достаточно, чтобы обеспечить изгибание мембраны в сложные структуры.

Вам, возможно, интересно, могут ли амфифилы выстраиваться так, чтобы гидрофильные головки оказывались внутри, а гидрофобные хвосты – снаружи. Да, могут, и вы создаете такие структуры всякий раз, когда пускаете мыльные пузыри.

В оболочке пузыря молекулы мыла выстраиваются по обе стороны от тонкой водной пленки гидрофобными хвостами наружу, к воздуху. На глубинном уровне мыльные пленки и клеточные мембраны схожи – не забывайте об этом, когда моете посуду.

Туберкулез и плотные мембраны

В начале XIX века 30 % смертей в Лондоне вызывал туберкулез⁴, инфекционное заболевание, которое чаще всего поражает легкие. «Белая чума» поражала и убивала множество людей по всему миру и в первые полтора десятилетия XX века по-прежнему не покидала две верхние строки в списке главных причин смерти в США⁵. Даже сейчас от туберкулеза умирает около миллиона человек в год⁶. Эту болезнь вызывает бактерия Mycobacterium tuberculosis. Другая микобактерия, Mycobacterium leprae, вызывает лепру, или проказу, еще один бич человечества, тысячелетиями разъедавший кожу и нервную систему своих жертв, пока не появились современные антибиотики. Микобактерии отличаются потрясающей живучестью. Уже лет 100 мы знаем, например, что M. leprae и M. tuberculosis могут многими месяцами обходиться без воды⁷. Это озадачивает не только потому, что биохимическая активность клетки немыслима без воды. Если гидрофильные головки липидов не контактируют с водой, то как гидрофильным и гидрофобным взаимодействиям сохранять целостность мембраны и как мембране сохранять целостность бактерии?

Оказывается, у микобактерий очень странные мембраны. Как и у клеток всех остальных организмов, их внутренности ограничены липидным бислоем. Однако снаружи этот бислой покрыт густым гидрофобным гелем, над которым находится еще и монослой липидов, маслянистые хвосты которых направлены внутрь, а гидрофильные головки – наружу. Необычно здесь не только расположение липидов, но и их устройство: у многих молекул к гидрофильным головкам прикреплен сахар трегалоза (на рисунке на него указывает стрелка). Насколько мы знаем, микобактерии и некоторые их близкие родственники – единственные на планете организмы, наделенные трегалозными липидами. Но так ли это важно?

Я узнал об этих микобактериальных мембранах лет десять назад, вскоре после того, как основал свою исследовательскую лабораторию в Орегонском университете. К тому времени я уже несколько лет работал с липидными бислоями, в основном измеряя их жесткость и прочие физические свойства, чтобы понять, на что способны эти материалы. Экспериментируя с сахарами и полимерами, я скооперировался с группой химика Каролин Бертоцци, которая тогда работала в Калифорнийском университете в Беркли. По совпадению они тогда интенсивно изучали, как микобактерии создают трегалозные липиды и другие странные молекулы: группа Бертоцци хотела разобраться в выдуманных природой химических инструментах и научиться выводить их из строя, чтобы побеждать болезни. Именно в ходе этого сотрудничества я впервые услышал о трегалозных липидах и сразу же заинтересовался ими, поскольку трегалоза в иных контекстах слыла чуть ли не волшебным сахаром.

Лишь небольшое число организмов, включая некоторые грибы, растения и даже отдельных животных, способны пережить потерю 99 % воды. Так, «воскресающее растение» плаунок чешуелистный (Selaginella lepidophylla) годами выдерживает почти полную дегидратацию, сворачиваясь в плотный коричневатый шарик, который при поступлении воды «оживает», расправляясь в обычную зеленую розетку листьев. У многих из этих организмов есть кое-что общее: они производят трегалозу, часто в огромных количествах. В сравнении с сахарами вроде знакомых нам глюкозы или сахарозы трегалоза менее склонна кристаллизоваться с ростом концентрации, благодаря чему ее молекулам проще взаимодействовать с другими веществами. Кроме того, трегалоза легко формирует водородные связи – те, что скрепляют молекулы воды друг с другом и с разными гидрофильными молекулами: это позволяет сахару в некоторой степени имитировать воду. Но трегалоза, в отличие от воды, не склонна к испарению. Считается, что все эти свойства делают трегалозу фактором устойчивости к иссушению, и ученые ищут способы использовать ее вне организма – чтобы хранить и транспортировать в высушенном состоянии вакцины и биоматериалы типа клеток крови и ценных белков⁸. Я задумался: а не приспособили ли микобактерии трегалозный инструментарий в связке с липидами для защиты своей клеточной оболочки от обезвоживания? И как же проверить эту гипотезу?

Нельзя было просто отключить у микробов производство трегалозных липидов, а затем проверять их на прочность: о подобных биохимических механизмах микобактерий мы знаем слишком мало, чтобы их менять. Но даже если бы это было в наших силах, я не горел желанием держать в лаборатории возбудителя туберкулеза. (Как мы позже узнаем, моя группа с удовольствием работала с холерными вибрионами, но холеру легко предупредить, сложно подхватить, просто излечить – в отличие от туберкулеза.) Я выбрал другой подход, который уже десятки лет успешно работал с «нормальными» липидными бислоями: воссоздание искусственных бесклеточных мембран на твердых поверхностях. Обычные липиды можно подтолкнуть к формированию бислоев на очень чистых и ровных стеклах. В силу гидрофильности стекла и липидных головок их разделяет водная прослойка толщиной 1–2 нанометра, позволяя бислою сохранять двумерную текучесть. Нам приходится жертвовать долей реализма целостной клеточной мембраны, зато мы получаем удобную контролируемую платформу для изучения биофизики липидного бислоя.

Мы решили попробовать сконструировать аналогичную мембранную платформу, чтобы имитировать небислойную организацию липидов у M. tuberculosis. Сначала мы химически связали гидрофобные молекулы со стеклянными подложками. Отдельно на поверхности воды, заполняющей специальные кюветы, сформировали монослои липидов с торчащими в воздух гидрофобными хвостами и аккуратно перенесли их на стеклянные подложки так, чтобы хвосты связались с уже нанесенным гидрофобным слоем. Наши монослои состояли из вполне распространенных липидов с нужной долей очищенных трегалозных форм. Как и у живых микобактерий, под монослоем с трегалозными липидами у наших искусственных мембран находился плотный гидрофобный слой.

На базе такой платформы мы могли дегидратировать и регидратировать полученную мембрану. Как и ожидалось, монослои исключительно из «обычных» липидов не выживали при высушивании. Зато монослои, почти полностью состоящие из микобактериальных трегалозных липидов, после дегидратации и регидратации оставались невредимыми и даже сохраняли текучесть. Но примечательнее было то, что монослои из смеси обычных и трегалозных липидов выдерживали обезвоживание, пока содержание трегалозных форм в них не падало ниже 25 %. Иными словами, даже находясь в меньшинстве, трегалозные липиды обеспечивали устойчивость мембраны к дегидратации. Вместе с коллегами из лаборатории Бертоцци мы пошли еще дальше: в частности, Дэвид Рабука создал синтетические липиды: их головка содержала трегалозу, а вот хвостовые цепочки были как у других, стандартных липидов. (У природных микобактериальных липидов гигантские гидрофобные хвосты. Можно было предположить, что их цепочки как-то по-особому переплетаются, и именно благодаря такой запутанности, а вовсе не трегалозе, консервируются мембраны.) Эти химерные молекулы спасали мембраны от обезвоживания не хуже микобактериальных липидов, что указывало на саму трегалозу как защитный фактор. Такой результат удовлетворил наших коллег, меня и мою зарождавшуюся исследовательскую группу⁹.

Очевидно, возбудители туберкулеза и лепры нашли хитрый и надежный способ сопротивляться стрессу, привязывая сахара к липидам и, разумеется, эксплуатируя самосборку липидов в мембраны для формирования своей поверхности. Можно ли сконструировать еще более устойчивые к иссушению слои, например с несколькими трегалозными остатками на молекулу липида, для решения проблемы хранения биоматериалов? Можно ли разрушать связанную с липидами трегалозу, чтобы бороться с туберкулезом? Не знаю, будущее покажет.

Организация двумерной жидкости

Если вернуться к обычным клеточным мембранам, то двумерная текучесть липидных бислоев создает клетке потенциальную проблему: как ей организовывать свою мембрану, чтобы одни белки кластерировались со своими партнерами, а другие оставались в одиночестве, если мембрана в целом – это жидкость? Можно, например, как делают Т-лимфоциты, связать мембранные белки с внутренним каркасом клетки, рельсы и моторы которого будут направлять их куда надо. А можно выбрать другую тактику, вытекающую из физических свойств самой мембраны и задействующую два типа липидов. Оба формируют текучие бислои, предназначенные для защиты гидрофобных хвостов от воды, но каждый предпочитает окружение себе подобных: липиды А тяготеют к А, а липиды B – к B. Как масло и вода, два типа липидов не смешиваются, однако их сегрегация ограничивается двумерным пространством бислоя. В последние десятилетия XX века ученые поняли, что подобная сегрегация в стандартном наборе мембранных липидов вполне возможна. Гидрофобные хвосты разных липидов могут быть как относительно жесткими, так и относительно гибкими, в зависимости от типа химической связи между их атомами. В случае сочетания липидов с жесткими и гибкими хвостами и холестерина (который в изобилии представлен в клеточных мембранах) формируются бислои, напоминающие коктейль из двух разных составов, сосуществующих друг с другом. Один состав богат холестерином и липидами с жесткими хвостами, другой – липидами с гибкими хвостами. Их сегрегация демонстрирует все признаки фазового разделения, которое физики изучают уже не первый десяток лет, особенно в контексте его зависимости от температуры. Если температура превышает какое-то критическое значение, разные липиды перемешиваются (см. верхний рисунок), а если не достигает его – сегрегируются в соответствии со своими предпочтениями (нижний рисунок).

Как и в случае с плавлением ДНК (см. главу 1), переход происходит резко, и аналитический инструментарий, разработанный для небиологических материалов, снова находит применение в живой природе. Обнаруженная картина наводит на мысль, что клетки могли бы использовать это холестерин-зависимое фазовое разделение для организации своих мембран. Разные белки с одинаковыми предпочтениями – любители богатой холестерином фазы и нелюбители – распределялись бы по разным областям. Искусственные мембраны сильно облегчают нам изучение фазового разделения липидов. В лаборатории несложно сконструировать из липидного бислоя сферы размером с клетку и использовать их как инструмент для изучения биофизики мембран и мембранных белков. (Они напоминают мыльные пузыри, но вместо воздуха у них внутри и снаружи вода, а оболочкой служит липидный бислой.) Глядя в микроскоп на мембрану, помеченную разными пигментами, предпочитающими богатые или небогатые холестерином домены, – например, светло-серым и темно-серым, как на рисунке, – мы увидим диски одного цвета в море другого.

Мы быстро поняли, что по этому принципу могла бы происходить пространственная организация в настоящих клетках, но ответить на вопрос, происходит ли она так, сложно до сих пор. В искусственных мембранах богатые и небогатые холестерином домены вырастают до размеров, легко различимых под микроскопом. Более того, понижая и повышая температуру, можно наблюдать, как домены возникают и исчезают. Загадка же в том, что в живых клетках эти домены никто не видит, хотя мы и знаем, что липиды и холестерин, из которых они состоят, ничем не отличаются от используемых в искусственных мембранах. Предполагают, что домены все же существуют, однако компоненты цитоскелета ограничивают их площадь несколькими десятками нанометров, в то время как волновая природа света не позволяет нам видеть структуры размером меньше нескольких сотен нанометров. Разумеется, нас эта ситуация не устраивает: утверждение, что объект существует, но наблюдению не поддается, совсем не добавляет уверенности в том, что он действительно существует! Однако интересно, что, химически воздействуя на клетки, можно создать «волдыри» – пузырьки на клеточной мембране, отделенные от цитоскелета¹⁰. В них уже явно различимы липидные домены, демонстрирующие все признаки фазового разделения жидкости, о чем в 2007 году впервые сообщили Уотт Уэбб и его коллеги из Корнеллского университета.

Эксперименты с пузырьками придали веса гипотезе о том, что в настоящих мембранах действительно происходит фазовое разделение. И все же можно было возразить, что в эксперименте мы подвергали мембраны жесткому воздействию и потому не вправе отождествлять с природными. Недавно ученые заметили у дрожжевых клеток крупные домены в мембране, ограничивающей органеллу под названием вакуоль¹¹. В Вашингтонском университете группа под руководством Сары Келлер выявила, что в живых дрожжевых клетках эти мембраны демонстрируют признаки фазового разделения: самым показательным было образование доменов лишь при падении температуры ниже критической отметки. Любопытно, что дрожжевые клетки, по всей видимости, используют такие домены для расщепления накопленных жиров, когда нет доступных сахаров: именно там концентрируются необходимые для этого белки¹². Пока неясно, обращаются ли другие клетки к подобным стратегиям, но гипотеза о том, что клетки используют принцип фазового разделения жидкости в организации своих мембран, все больше кажется не только изящной, но и верной.

Структура мембран и самосборка

Представление о клеточных мембранах как двумерных жидкостях, существующих благодаря самоорганизующемуся липидному бислою, укрепилось в 1970-х после нескольких десятилетий изучения природы биологических мембран¹³. Архитектура липидного бислоя поразительно изящна: она не только объясняет многие аспекты поведения мембран, но и показывает, что поведение это вытекает из простых физических взаимодействий. Кажется, что в силу огромной биологической значимости мембран клетки должны тщательно контролировать расположение липидов и создавать выверенные химические связи, чтобы удерживать их вместе. Но это не так: липиды могут действовать на свое усмотрение, подобно тому как капля масла, плавающая в воде, может принять форму хоть куба, хоть лучистой звезды. Но капля предпочитает быть сферой – просто потому, что такая форма минимизирует площадь соприкосновения масла с водой. Так и липиды выстраиваются в бислой просто потому, что такая форма сводит к минимуму контакт их гидрофобных хвостов с водой. Клетке не нужно задействовать гены, чтобы подтолкнуть липиды к формированию бислоев, липиды это делают сами. (Клетке нужны гены белков, синтезирующих молекулы липидов, однако уже созданные липиды способны к самоорганизации.)

Как и при фолдинге белков, здесь мы наблюдаем в действии крайне эффективный принцип самосборки: простые физические требования движут формированием структуры, позволяя молекулам самим выстраиваться в нужном порядке. Эксплуатация самосборки не только удобна природе, но и полезна в качестве примера для всех, кто природу изучает: этот феномен свидетельствует, что жизнь не обязательно устроена так замысловато, как кажется на первый взгляд, и в основе биологической сложности вполне может лежать физическая простота.

Итак, мы познакомились с важнейшими молекулами, из которых состоят все организмы на Земле: ДНК, РНК, белками и липидами. Это, конечно, не полный набор ингредиентов жизни – важный вклад в нее вносят ионы, сахара, гормоны и другие молекулы, – но характеристики этой группы универсальных компонентов сообщают нам многое о том, как устроена жизнь и как в живой природе кодируется информация. Выстраиваясь и взаимодействуя множеством разных способов, эти молекулы порождают все многообразие жизни вокруг нас. Мы продолжим изучать разные типы биологических структур и физические силы, которые задают рамки при их формировании, но сначала погрузимся в важную биофизическую тему, до этого затронутую лишь вскользь, – поговорим о предсказуемой случайности.

Если зарисовать пути, которые мой блуждающий микроскопический шарик мог бы пройти за 10 секунд, мы получим всевозможные запутанные траектории. Ни маршрут шарика, ни конечную точку его пути невозможно спрогнозировать. Его движение случайно.

Но с этой случайностью сосуществует своего рода предсказуемость. Я не могу заранее сказать, какой стороной упадет подброшенная монетка, но знаю, что если подбросить ее много раз, то примерно в половине случаев выпадет решка, а в половине – орел. Точно так же и со статистикой броуновского движения: если я понаблюдаю за несколькими десятками 10-секундных скитаний шарика, который всякий раз движется от центра страницы, и отмечу конечную точку каждого его пути, у меня получится набор точек типа темного облака, изображенного на рисунке.

Хотя конечные положения случайны, среднее расстояние от начальной точки четко определено. Каким образом оно зависит от времени в пути? Если вы сейчас испытываете дежавю, отлично! По сути своей это эквивалентно вопросу о размере клубка ДНК из главы 3. Там мы узнали, что случайное блуждание на N шагов в среднем оканчивается на расстоянии N² шагов от начальной точки. Здесь же в каждое мгновение бомбардировки атомами жидкости наша броуновская частица получает случайный толчок, заставляющий ее «шагнуть» в случайном направлении. Следовательно, в среднем расстояние, которое проходит частица, пропорционально квадратному корню времени ее движения. График зависимости типичного расстояния от времени здесь представляет собой уже не прямую, а изогнутую линию.

Если частица будет двигаться в четыре раза дольше, в среднем она будет проходить лишь вдвое большее расстояние. Чтобы переместиться в среднем в три раза дальше, ей нужно двигаться в девять раз дольше.

Помимо времени броуновское движение зависит и от размера частицы. Это логично: мы ведь утверждали, что беспорядочное движение имеет значение для микроскопических частиц, и нам отлично известно, что крупные тела вроде арбузов и мячей не катаются хаотично по полу ни с того ни с сего. Все частицы в среднем смещаются на расстояние, которое увеличивается пропорционально квадрату времени, но у мелких частиц это увеличение больше, чем у крупных. Все частицы получают одинаковый толчок от внешней тепловой энергии, но мелкие частицы реагируют на него сильнее.

Беспорядочное движение молекул в специфических контекстах еще называют диффузией: этот термин часто применяют в отношении красителей, перемещающихся по жидкости, и газов, разносящихся по воздуху. Отмечу, однако, что типичная для школьного урока демонстрация распространения запаха духо́в на самом деле не иллюстрирует диффузию. Парфюмерные молекулы, несомненно, пребывают в броуновском движении, но по комнате они распространяются главным образом благодаря потокам воздуха, возникающим из-за температурной неоднородности, работы вентиляции, перемещений людей и прочих возмущений среды.

Малые элементы в клеточном строительстве

Броуновское движение не только подводит нас к очевидному заключению, что соли и сахара, липиды, белки и даже целые клетки постоянно пребывают в возбуждении, но и проливает свет на множество биологических процессов². Прежде всего, оно устраняет назойливую шероховатость в наших обсуждениях самосборки. Мы узнали, что белки сворачиваются в специфические трехмерные формы под влиянием физических взаимодействий собственных аминокислот. Кирпичики лего тоже специфически взаимодействуют друг с другом, однако груда кирпичиков сама по себе не собирается в какую-то форму. Броуновское движение объясняет, в чем здесь разница. В силу своего малого размера аминокислотная цепь постоянно пребывает в активном движении. Молекула непрестанно извивается, сближая то одни, то другие аминокислоты с третьими, пока не остановится на структуре с достаточной для фиксации силой взаимодействия. Примерно так же тепловая энергия вызывает беспорядочное движение липидов: они находят друг друга и выстраиваются в мембрану. Таким образом, в рецепт для самосборки входят не одни физические взаимодействия, а физические взаимодействия в сочетании с броуновским движением.

Экспрессия и регуляция генов тоже зависят от броуновского движения. Мы описали, как факторы транскрипции связываются с ДНК, но обошли вниманием вопрос о том, как они находят свои последовательности-мишени. Не существует ни направляющей руки, ни рельсов, которые доставляли бы их прямиком к пункту назначения. Подгоняемые тепловой энергией, белки блуждают по пространству клетки, сталкиваясь со всевозможными участками ДНК и задерживась лишь на тех, которые они специфически распознают. Как и самосборка, эта стратегия управления не сработает с макроскопическим телом: я не могу положить на пол ключ от своего кабинета и надеяться, что он сам как-то попадет в дверной замок, – но в микроскопическом мире она очень успешна.

Чем определяется скорость мышления?

Броуновское движение проливает свет даже на глубокую связь строения и времени. В качестве примера рассмотрим взаимодействие двух нейронов.

Нейроны могут вступать в два типа контактов. При образовании контакта первого типа, химического синапса, две клетки находятся на расстоянии пары десятков нанометров друг от друга[33]. Клетки общаются путем передачи через этот зазор химических веществ, называемых нейромедиаторами или нейротрансмиттерами (серые точки на рисунке).

Существует множество нейромедиаторов и множество веществ, включая фармпрепараты, которые управляют их высвобождением, обратным захватом и разложением. Например, никотин и некоторые препараты для лечения болезни Альцгеймера повышают уровень ацетилхолина. Другой нейромедиатор, аденозин, снижает активность мозга, вызывая сонливость, а кофеин блокирует рецептор аденозина, тем самым мешая вам заснуть. Как же нейроны отправляют и получают медиаторы по химическому синапсу? Им достаточно лишь высвободить эти вещества в синаптическую щель и позволить им распространяться путем диффузии. Молекулы свободно блуждают по зазору и когда случайно натыкаются на рецепторы клетки-мишени, связываются с ними и запускают соответствующий нейронный ответ. То есть здесь не нужны никакие специальные механизмы – ни наномерный перевозчик, ни толкающие электромагнитные силы. Молекулы нейромедиаторов очень малы – их размеры колеблются в районе нанометра, – и мощное броуновское движение переносит их на пару десятков нанометров за какую-нибудь микросекунду.

Если зайти с другой стороны, можно поинтересоваться, как быстро информация передается по химическому синапсу. Если при активации одного нейрона электрический сигнал проходит по нему до самой дальней части, новость о его активации должна передаваться следующей клетке в цепи – например, другому нейрону или мышечной клетке. Как мы узнали, на передачу этой эстафетной палочки клетки тратят около микросекунды. Разумеется, это грубая оценка. Строго говоря, нам нужно спрашивать, за какое время синаптическую щель преодолеет пороговое количество случайных блуждающих, а не одна среднестатистическая молекула. Но так или иначе речь здесь идет о микросекундах, то есть миллионных долях секунды. Учитывая физические размеры синапса, мы не видим причин, почему бы времени требовалось значительно больше – например, тысячные секунды, – и не видим физической возможности для того, чтобы времени тратилось значительно меньше – скажем, миллиардные секунды.

Мне с детства было интересно, чем определяется скорость мышления – почему минута кажется минутой, а не годом и почему не получается прочувствовать каждую миллисекунду наших переживаний. Скорость общения нейронов через химический синапс неизбежно определяется броуновским движением. Существует еще пара способов передачи информации в мозге, и динамика у каждого из них своя. Но все пути переноса биологической информации так или иначе регулируются молекулярными потоками с их неотъемлемой компонентой – броуновским движением, помогающим задавать скорость работы нашего мозга.

Микросекундные сроки, характерные для химического синапса, довольно малы и, несомненно, соответствуют нашим нуждам. Любопытно, однако, сравнить их со скоростью работы современных компьютеров, которые затрачивают на операцию около наносекунды, то есть одной миллиардной секунды. Мой ноутбук функционирует многократно быстрее моего мозга. Вместо движения молекул он использует движение гораздо более мелких частиц, электронов, да еще и перемещает их принудительно с помощью электрических полей. В сравнении с ним мой мозг работает медленно, но схема взаимодействий моих нейронов гораздо сложнее схемы связей между транзисторами в центральном процессоре ноутбука³. Нейронная архитектура позволяет параллельно совершать головокружительное количество вычислений в разных группах клеток, а не выполнять их строго по очереди. Связность и параллельность сильно помогают в решении концептуально сложных задач. Любопытно представить, что случится, когда машины превзойдут нас и по скорости вычислений, и по сложности сети, ведь вполне вероятно, что этот день уже не за горами.

Транспортировка грузов в клетках

В приведенном выше примере нейрон просто высвобождает нейромедиаторы, точно зная, что за приемлемое время они диффундируют до мишени. Подобным образом броуновское движение используют и другие клетки. Как помните, в главе 4 мы говорили о бактерии, которая любит лактозу: lac-репрессор может как встретиться, так и не встретиться с лактозой, поглощенной бактерией из внешней среды, и от этого зависит, свяжется ли он с нужным участком ДНК, чтобы остановить производство белков, расщепляющих лактозу. Как lac-репрессор находит ту самую ДНК? Опять же ничего особенного, никаких направляющих он не использует. Белок просто блуждает. Благодаря малому размеру его хаотичное движение довольно интенсивно, и репрессор способен преодолеть расстояние в микрометр, близкое к диаметру типичной бактерии, за сотую долю секунды. Чтобы достичь определенной точки – например, своей ДНК-мишени, – он затратит больше времени, поскольку лишь единичные случайные траектории будут ему полезны. И все же для попадания в любую заданную точку ему хватает в среднем десятой доли секунды. Следовательно, нет ничего удивительного в том, что бактерия, получив информацию из окружающей среды, способна за доли секунды принять взвешенные решения.

Теперь представьте типичную эукариотическую клетку – например, один из ваших лейкоцитов. Его диаметр составляет около 10 микрометров, что в 10 раз больше диаметра типичной бактерии. Чтобы покрыть расстояние, равное диаметру лейкоцита, белку понадобится в 10², то есть в 100 раз больше времени. Найти нужную мишень, например промотор гена, ему будет сложнее. Оказывается, в среднем он должен затрачивать на это время, пропорциональное размеру клетки в кубе (10 × 10 × 10), то есть искать цель в лейкоците белок будет в 1000 раз дольше, чем в бактерии⁴. Вместо десятой доли секунды на реакцию уйдет почти две минуты – а это много!

Дабы не впасть в летаргию, эукариоты выбирают более активный подход и перемещают грузы с помощью моторных белков⁵. Мы уже знакомы с одним из них, кинетином, который одним концом захватывает заключенный в липидно-белковую оболочку материал, а другим шагает по микротрубочке.

Кинетин передвигается со средней скоростью около 2 микрометров в секунду, а значит, может пересечь эукариотическую клетку за несколько секунд. Диффундирующим молекулам для этого потребовались бы минуты. Но даже здесь клетка эксплуатирует случайность: моторному белку не нужно доставлять груз до самого пункта назначения, а достаточно лишь переместить его поближе, чтобы на последнем отрезке пути дело завершило броуновское движение. (Например, достигнув ядра после выхода из начальной точки на другом конце крупной клетки, фактор транскрипции может уже путем диффузии быстро добраться до своей ДНК-мишени, расположенной не дальше микрометра.) Польза молекул вроде кинетина очевидна, но она имеет свою цену: клетка вынуждена расходовать энергию на работу моторных белков, в то время как броуновское движение Вселенная предоставляет бесплатно.

Несмотря на активные исследования, никто пока не обнаружил подобные кинетину моторные белки в прокариотических клетках (бактериях и археях). С точки зрения биофизики это закономерно: не то чтобы бактерии не смогли развить их в ходе эволюции – они просто не испытывают в них необходимости. В малых масштабах броуновское движение происходит быстро, в крупных – медленно. Поскольку бактерии в большинстве своем малы, они могут спокойно положиться на случайность в удовлетворении своих внутренних транспортных потребностей.

Зачем бактерии плавают?

Транспортировка вне бактерий и перемещение их самих тоже не обходятся без случайности. Большинство бактерий подвижны и могут, например, плавать в жидкости. Так, у E. coli есть несколько нитевидных жгутиков, при вращении которых в одну сторону организм движется вперед, а в другую – кувыркается[34]. Эти микробы постоянно пребывают в движении, и под микроскопом видно, как они снуют из стороны в сторону в чашке с водой.

Можно подумать, что бактерии плавают ради поглощения пищевых частиц, подобно миниатюрным усатым китам, собирающим криль на своем пути, но физика это опровергает. E. coli плавает со скоростью около 10 микрометров в секунду, а значит, если бы в микрометре от нее (то есть на расстоянии, сравнимом с длиной ее тела) находилась пища, бактерии понадобилось бы около десятой доли секунды, чтобы к ней подплыть. Их пища – это сахара и другие молекулы размером менее одной тысячной микрометра, такие маленькие, что за миллисекунду могут преодолеть расстояние в целый микрометр. Будь вы бактерией, пища достигала бы вас путем диффузии гораздо быстрее, чем вы до нее доплывали бы! Как отметил физик Эдвард Пёрселл, «вы можете носиться как угорелый, но тот парень, что спокойно сидит в ожидании диффузии», получит не меньше.

Зачем же тогда им плавать? Бактерии вроде E. coli измеряют концентрацию питательных веществ в окружающей среде по изменению загруженности клеточных рецепторов их молекулами и перемещаются в направлении повышения концентрации. И снова процитирую Пёрселла: «(Бактерия) может находить места, где пища лучше или где ее больше. То есть она движется не как пасущаяся на лугу корова, а стремится туда, где луга зеленее». Благодаря многолетним исследованиям мы теперь можем в подробностях описать, как E. coli оценивает обстановку и принимает решения: как обнаружение питательных веществ поэтапно воздействует на белки, контролирующие жгутики, чтобы те позволяли клетке дольше плыть прямо по градиенту концентрации питательных веществ и чаще крутиться при движении в менее удачном направлении. Механизмы такого же типа работают у очень разных бактерий, включая тех, что привыкли прокладывать себе путь в организмы животных⁶. Похожие системы характерны и для многих эукариотических клеток – например, иммуноцитов, мигрирующих к ранам.

Итак, мы познакомились со многими компонентами клеток и физическими закономерностями, управляющими их сборкой, динамикой и принятием решений. Клетки, конечно, восхитительны – это живые, растущие, размножающиеся сущности, которых только в каждом из нас триллионы. Но клетки поражают нас еще сильнее, когда работают вместе. Во второй части этой книги мы расширим поле зрения до клеточных объединений, включая эмбрионы, органы, бактериальные сообщества и целые организмы всех форм и размеров, – и снова увидим в работе общие биофизические принципы, потому что взаимодействующие клетки тоже осуществляют самосборку, принимают решения с помощью регуляторных схем, имеют дело со случайностью и увеличивают свои размеры масштабированием.

Градиенты Sonic hedgehog руководят организацией и других частей тела, не только конечностей: они играют важную роль в формировании нервной системы, легких, зубов, черт лица и многого другого. Кроме того, этот белок проявляет себя при раке: развитие злокачественных опухолей часто сопряжено с активацией эмбриональных генетических процессов, подстегивающих стремительный, но в этом случае нежелательный рост⁷.

Sonic hedgehog – один из многих морфогенов, веществ, которые управляют формообразованием посредством разницы их концентраций. Существование морфогенов в 1952 году, за несколько десятилетий до обнаружения реальных примеров, предсказал математик и пионер информатики Алан Тьюринг; он даже дал им название в своей провидческой статье о теоретической возможности существования таких систем⁸. В каждом развивающемся эмбрионе сосуществуют и взаимодействуют многочисленные морфогенные градиенты.

Что же делают морфогены? Чаще всего они либо напрямую, либо через посредников регулируют транскрипцию, включая и выключая разные гены, как описано в главе 4. Эффективность фактора транскрипции зависит от его концентрации. Это тоже вытекает из физики: связывание любой молекулы с любой другой происходит в постоянной суматохе прикреплений и откреплений, и вероятность того, что какой-то фактор транскрипции свяжется с ДНК-мишенью, тем выше, чем больше его копий плавает в среде. Функция отклика – вероятности того, что ген экспрессируется, или изменения уровня синтеза его белка – может быть гладкой, отражающей его зависимость от концентрации активатора или репрессора транскрипции, или с резким изломом, как при переключении тумблера – когда отклик может быть почти нулевым при низкой концентрации активатора и высоким («включенным») после превышения какого-то его порогового уровня.

Зависимость экспрессии генов от концентрации регуляторов может порождать удивительно замысловатые паттерны распределения их продуктов. Давайте рассмотрим упрощенный пример, а затем и реальность. Представьте эмбрион в форме удлиненной пилюли. Пока все соответствует действительности: на ранних стадиях развития почти все организмы представляют собой шары или эллипсоиды – поначалу все мы пузыревидны. Допустим, источник морфогенов находится в левой части эмбриона и сформирован из особых клеток или материалов, предоставленных матерью. Морфоген А распространяется путем диффузии и формирует градиент концентрации, которая постепенно снижается к другому полюсу эмбриона (левое изображение в верхнем ряду). Если отклик на морфоген А осуществляется переключением – ген включается, когда А много, и выключается, когда А мало, – профиль производства продукта этого гена будет ступенчатым (верхний ряд, справа).

Теперь допустим, что в той же области образуется и морфоген B. Возможно, из-за большего размера его молекулы случайные блуждания B не столь интенсивны, следовательно, градиент его концентрации компактнее, резче и зона того же переключательного отклика ограничена меньшим пространством (средний ряд).

Как вы помните из четвертой главы, клетки могут создавать из генов схемы, отклик которых зависит от входящих сигналов. Следовательно, схема, которая включается, когда A много, а B мало, и выключается при любой другой комбинации, даст профиль экспрессии в форме полосы, чуть смещенной влево от центра. Схема, чувствительная к комбинации «мало А и мало B», откликнется лишь в правой половине эмбриона (нижний ряд).

Градиенты концентраций всего двух факторов транскрипции могут породить более двух пространственных паттернов генной экспрессии. Активированный ген может кодировать белок, ответственный за онтогенетический процесс со строго определенным «адресом», либо другой фактор транскрипции, способный взаимодействовать с первыми двумя. Допустим, фактор C управляется схемой «много А и мало B» и распространяется путем диффузии (см. следующий рисунок). Тогда схема «много C и мало A» будет активна в узкой полосе сразу за правой границей области синтеза C – там, где А уже мало, а диффундирующего C еще достаточно, чтобы считать его концентрацию высокой.

Узкая полоса иллюстрирует точность организации, обеспечиваемую небольшим числом морфогенов. Когда факторов транскрипции с характерными для них градиентами становится больше, спектр возможностей резко расширяется. Несложно представить, как можно задать специфические паттерны экспрессии генов, точно соответствующие назначению клеток, из которых формируются те или иные органы и ткани.

В теории это кажется убедительным, и организмы действительно применяют этот подход на практике. Процесс формирования паттернов мы уже несколько десятилетий приблизительно представляем и наблюдаем размытие концентраций факторов транскрипции и соответствующее профилирование экспрессии генов. В последние годы удается детальнее изучать эти процессы у все большего спектра организмов и с возрастающим числом вовлеченных генов. Лучше всего мы разбираемся в пространственной организации эмбрионов дрозофил, которых изначально исследовали уже знакомые нам Нюслайн-Фольхард и Вишаус. На ранних стадиях развития – задолго до появления ног, крыльев и даже головы – эмбрион мушки представляет собой тот самый удлиненный эллипс, что мы изображали чуть выше. У одного из полюсов внутри своей яйцеклетки (условно переднего, головного) мушка-мать оставляет наследство в виде мРНК, благодаря трансляции которой в зиготе создается стартовый градиент фактора транскрипции Bicoid, подобный градиенту нашего гипотетического морфогена B. Этот градиент задает передне-заднюю ось формирующегося тела. Bicoid связывается с промотором гена hunchback и активирует его экспрессию. Градиент концентрации белка Hunchback тоже ориентирован спереди назад. Далее широкими полосами экспрессируются еще полдюжины генов, комбинированные эффекты которых приводят к появлению более узких профилей экспрессии – например, семи полосок активности гена even-skipped[36], которые появляются всего через три часа после оплодотворения яйцеклетки.

Паттерны экспрессии even-skipped и других генов предопределяют разделение тела мушки на 14 сегментов. Из разных сегментов формируются разные структуры. Три сегмента, например, образуют грудной отдел, и на каждом из них при участии гена hedgehog вырастает по паре ног.

Особенно приятно, что наши биофизические знания позволяют измерять и предсказывать эти специфические паттерны полосок и сегментов, играющие важнейшую роль в определении плана тела любой зарождающейся дрозофилы. Что касается измерений, можно в живых эмбрионах исследовать транскрипцию интересующего гена, обеспечивая взаимодействие его РНК с фрагментами ДНК или РНК-связывающими белками, меченными флуоресцентным белком вроде GFP (см. главу 2): его легко локализовать по свечению. Если пришить ДНК флуоресцентного белка прямо к последовательности интересующего гена, можно по интенсивности свечения отслеживать количество его белкового продукта. В любом случае свечение служит точным, количественно измеримым показателем, позволяющим понять, что, где и когда происходит в онтогенезе⁹. Что касается прогнозирования, можно с помощью уравнений броуновского движения и функций генетического отклика рассчитать паттерны распределения белков и активности генов¹⁰. Эти расчетные данные пока не идеально отражают природные закономерности, но определяемые ими размеры и время появления полосок и зазоров довольно точно согласуются с реальной картиной мушиного эмбриогенеза.

Вообще плодовая мушка способна на гораздо более тонкую настройку в организации зародыша. В гипотетическом примере мы рассматривали лишь два уровня чтения гена – при низкой и при высокой концентрации морфогена. Но клетки могут обладать более утонченной чувствительностью и давать три разных ответа на три уровня морфогена (низкий, средний, высокий), а то и на четыре, пять и более. Казалось бы, неплохо различать больше уровней, ведь тогда организм станет высокоструктурированным за счет меньшего количества ингредиентов. Что же ограничивает точность эмбриона? Может ли плодовая мушка распознавать тысячу разных концентраций Bicoid в тысяче разных точек тела, формируя тысячу разных анатомических черт на базе единственного пространственного градиента?

Это тоже вопрос биофизики. Пределы точности такого структурирования задаются беспорядочностью диффузионного движения (см. главу 6) и хаотичностью молекулярного связывания, которую мы пока не рассматривали в деталях, но которая в основе своей схожа с броуновским движением. Несложно сказать, где в среднем окажется облако молекул в процессе диффузии, но насколько хорошо это среднее представляет все облако, зависит от количества движущихся молекул. Я совершенно уверен, что если подброшу миллион монеток, то получу примерно половину выпавших решек. Если же я подброшу шесть монеток, то ничуть не удивлюсь, увидев четыре решки и два орла. Подобным образом эмбрион может создавать обилие молекул морфогена, формируя плавный и четко очерченный градиент, который действительно позволяет вычленять множество разных уровней концентрации. Зародыш может производить и всего несколько молекул, тратя меньше сил и энергии, но это приводит к построению сильнее «зашумленных» градиентов, которые можно считывать лишь грубо – как области с высокой или низкой концентрацией. Судя по экспериментам, эмбрионы предпочитают скорее близкую ко второй стратегию: молекул морфогена не миллионы, и нечеткость градиентов существенна.

Пока неясно, как эта статистическая вариативность соотносится с точностью эмбрионального развития, но мы уже можем задаться вопросом, какие ограничения она накладывает на структурирование. В прекрасной статье 2013 года Уильям Бялек и его коллеги из Принстонского университета связали морфогенные измерения с теорией информации, чтобы выяснить, сколько битов закодировано в эмбрионе дрозофилы¹¹. Если концентрация фактора транскрипции оценивается только как «высокая» или «низкая», ее можно закодировать в одном бите информации: мы отметили в первой главе, что один бит имеет два состояния. Если концентрация оценивается как «высокая», «средне-высокая», «средне-низкая» и «низкая», для кодирования четырех возможных состояний нам понадобится два бита. Неизвестно, сколько состояний активности каждого гена может различить регуляторная сеть мушки, и потому напрямую подсчитать число необходимых битов мы не можем. Бялек с коллегами, однако, поняли, что вариативность положений полосок и границ при сравнении разных эмбрионов отражает количество битов, используемых в структурировании. По сути, чем больше битов, тем выше точность и ниже вариативность, и наоборот. Анализ визуализаций эмбрионального развития дрозофилы, в частности паттернов экспрессии четырех генов, которые появляются вслед за паттерном bicoid и контролируют организацию тканей, показал, что на один ген приходится примерно два бита информации. Вместе четыре гена способны определять структуру с пространственной точностью около 1 %.

И снова мы сталкиваемся с поразительным свойством живого мира – созданием замечательных форм на основе скудного набора инструкций. Возможно, личинка не особо вписывается в ваши представления о «замечательном», но если мушки и не производят на вас впечатления, не забывайте, что эти податливые и удобные для изучения организмы позволили нам открыть и описать явления, которые оказались широко распространены. Вероятно, и вам сначала хватало нескольких битов.

Знай своих соседей

В примерах построения структурных паттернов, которые мы рассматривали в этой главе, нам не приходилось думать о клетках. Мы можем представлять себе поля морфогенов и пласты тканей без учета отдельных единиц, которые реагируют на них или из которых они состоят. В случае с ранним эмбрионом мушки это даже нельзя считать упрощением: эллипсовидный зародыш состоит не из отдельных клеток, а из множества ядер, плавающих в общем цитоплазматическом море. Позже формируются мембраны, которые отделяют ядра друг от друга и ограничивают клетки. В эмбрионах позвоночных, включая человека, отдельные клетки есть с самого начала. В любом случае стоит клеткам возникнуть, как у них появляются дополнительные инструменты для структурирования.

Клетки могут передавать и получать сигналы, контактируя с другими клетками. Мы уже видели, как сигналами обмениваются иммунные клетки: мембранные белки преодолевают зазор между клетками, чтобы узнавать партнеров и запускать специфические реакции. Межклеточные контакты крайне важны и в онтогенезе, особенно в мелкомасштабном структурировании. Представьте слой клеток, каждая из которых может экспрессировать гены А и B. Эти гены могут служить факторами определения типа клеток – A или B. Допустим, любая клетка, вступающая в контакт с клеткой A, получает инструкцию не экспрессировать ген A; в итоге она экспрессирует ген B и становится клеткой типа B. Любая клетка, не вступающая в контакт с клеткой A, экспрессирует ген A и становится клеткой типа A. При таких правилах можно ожидать, что сложится показанная на рисунке мозаика, напоминающая пчелиные соты, где каждую из клеток А (они темные) окружает кольцо из B-соседок (они светлые).

Такой способ построения паттернов вполне типичен. Так, например, вы слышите благодаря тысячам волосковых клеток в вашем внутреннем ухе; они обязаны своим названием пучкам нитей, торчащим из их мембран и напоминающим крошечные ирокезы. Каждая волосковая клетка окружена когортой вспомогательных клеток, расстановка которых определяется как раз по описанной схеме, называемой латеральным торможением¹².

Латеральное (боковое) торможение определяет расположение клеток в фасеточных глазах насекомых, особенности гладкомышечных клеток в стенках артерий, формирование гормон-секретирующих клеток в поджелудочной железе и многое другое. Существование этого механизма предсказали еще в 1970-х, но наглядно продемонстрировали его работу в развивающемся животном лишь в следующем десятилетии. В середине 1980-х Кори Гудман и Крис Доу (теперь он работает вместе со мной в Орегонском университете) провели серию хитроумных экспериментов, в которых разрушали лазером особые клетки дрозофил, чтобы их соседки, не подавляемые более окружением, получили возможность экспрессировать гены, превращающие их в нейроны¹³.

Как клетка может управлять судьбой своих соседей? У множества разных клеточных пар во множестве разных организмов ключевой молекулой выступает белок Notch, пронизывающий поверхностную мембрану производящих его клеток. Его наружный сегмент может прикрепляться к мишеням вроде Delta, другого трансмембранного белка, выходящего из соседней клетки. Межклеточное рукопожатие этих двух белков подталкивает Notch изменить форму так, чтобы у него обнажился обычно скрытый участок, который распознают белки, разрезающие аминокислотные цепочки. (Наверное, страшно представить, что по клетке бродят вооруженные топорами белки, готовые разрубить своих товарищей надвое, стоит лишь их спровоцировать, но спровоцированное разрушение встречается в биологии сплошь и рядом.) Notch сначала разрезается над местом его выхода на поверхность, в результате чего высвобождается крупный внешний домен белка, который диффундирует и участвует в других событиях. Второй разрез внутри мембраны отделяет внутренний домен Notch от мембранного якоря. Этот фрагмент перемещается в ядро, где взаимодействует с другими белками, меняя характер их связывания с ДНК, – иными словами, он корректирует активность ряда факторов транскрипции и тем самым регулирует экспрессию генов. Внутриклеточный домен Notch в числе прочих эффектов подавляет экспрессию гена delta, чтобы клетка, контактирующая с белком Delta, не была клеткой, производящей его же, то есть экспрессирующей ген delta. Следовательно, в нашей A-B-схеме delta выступает в роли гена A.

Итак, Notch и Delta в паре координируют латеральное торможение. Notch, однако, может взаимодействовать и с другими белковыми партнерами, сидящими на других клетках, запуская другие сценарии разрезаний и генетической регуляции¹⁴. Некоторые из них могут подталкивать контактирующую клетку, наоборот, к выбору судьбы клетки A, тем самым распространяя этот тип по ткани. Помимо Notch и Delta в зонах межклеточных контактов встречается множество белков, участвующих в образовании тканевых паттернов, и их параметры связывания и функции отклика генов сильно разнятся. Подобно тому как в мозаике замысловатая картина постепенно складывается из маленьких соседних фрагментов, контактные сигналы могут организовывать сложные и устойчивые структуры по простым локальным правилам. И снова мы видим самосборку в действии, поскольку инструкции по более масштабной, межклеточной организации содержатся в самих клетках.

Знай время

Группы клеток могут организовываться не только в пространстве, но и во времени. Более того, с помощью временны́х сигналов они могут создавать пространственные паттерны – рисовать трехмерные орнаменты, образно говоря. Рассмотрим пример, в котором хронометрирование обеспечивает повторяемость формы. Полоски на шкуре тигра, ноги многоножки и позвонки вашего позвоночника – все они демонстрируют регулярную повторяемость черт и следуют друг за другом, не идентичные, но сильно схожие. Возьмем позвоночник. Внешне его упорядоченная костная структура напоминает полосы в эмбрионе дрозофилы, поэтому можно ожидать, что развивается она тоже под действием перекрывающихся градиентов морфогенов. Однако на ранних стадиях формирования мушки размер животного не меняется, пока гены строят схемы взаимодействий. Позвоночник же развивается из сегментов, которые появляются в ходе вашего стремительного роста, и это характерно для всех позвоночных. Человеческий эмбрион начинает удлиняться примерно с третьей недели после зачатия. Развивающееся тело – это не гладкая трубка: оно содержит равновеликие образования, называемые сомитами, которые попарно повторяются вдоль его передне-задней оси.

У человека формируется 42–44 пары сомитов (но некоторые из них исчезают в процессе дальнейшего развития), у рыбы данио-рерио – 30–32, у мыши – около 65, у некоторых змей – более 400¹⁵. Эмбрионы позвоночных достигают устойчивой регулярности в расположении десятков и сотен сомитов благодаря прекрасной способности к хронометрированию.

В главе 4 мы говорили, что клетки способны создавать осцилляторы и часы на основе генетических схем, поскольку гены экспрессируются ритмически. Эмбрионы часто пользуются такими часами. Первые несколько делений после оплодотворения, как правило, синхронизированы: обе клетки в двухклеточном эмбрионе делятся одновременно, и клеток становится четыре, затем они делятся все вместе, и клеток становится восемь – и так продолжается еще какое-то время, пока клеточное разнообразие не разваливает координацию.

У клеток удлиняющегося эмбриона, формирующих сомиты, тоже есть часы. В изолированных клетках происходят регулярные подъемы и спады экспрессии генов, и у клеток в составе ткани эти колебания синхронизированы. Как же эмбрион превращает такие временны́е ритмы в пространственные паттерны? В 1976 году Джонатан Кук и Эрик Кристофер Зиман описали изящную биофизическую стратегию¹⁶, и последующие эксперименты, особенно группы Оливье Пуркье из Института медицинских исследований Стоуэрса в Канзас-Сити, показали, что именно ее человек в числе прочих позвоночных использует для формирования сомитов: это привязывание генетических часов к градиенту морфогена.

Представьте группу клеток, где экспрессия генов колеблется синхронно. Допустим, уровень транскрипции гена в каждой клетке возрастает с 0 до 1, 2 и 3, затем снова падает до 0, и все повторяется. Выделив эти уровни на рисунке белым, светло-серым, темно-серым и черным соответственно, мы увидим синхронную коллективную осцилляцию.

Сначала все клетки белые:

Затем все светло-серые:

И так далее:

Теперь представим, что часы каждой клетки снабжены переключателем: отсчет времени ведется лишь тогда, когда локальная концентрация какой-то молекулы выше порогового уровня. Если же она падает ниже, часы останавливаются. Допустим, контролирующая молекула – это морфоген, вырабатываемый в хвостовой части животного, который распространяется путем диффузии и формирует градиент концентрации от хвоста к голове. Часы тогда будут работать у хвоста и останавливаться на некотором расстоянии от него. По мере роста эмбриона хвост все больше отдаляется от головы, и местоположение пороговой концентрации морфогена постоянно отодвигается назад. Клетки фиксируют уровни экспрессии генов, характерные для момента прохождения пороговой концентрации – иными словами, для момента остановки часов. Если в одной точке эмбриона уровень экспрессии какого-то гена равен 2, то далее он достигает 3, потом падает до 0, а затем уровни 1, 2 и 3 повторяются в периоде. Можно добавить на наш рисунок темную черту – границу, левее которой клеточные часы стоят, правее – идут, и хвост животного находится справа. Временной паттерн «замораживается» в виде пространственного паттерна экспрессии генов.

Если при высоких уровнях любой управляемой часами транскрипции будут создаваться границы сомитов, где клетки плотно прижаты друг к другу, а при низких – их выпуклые серединки, то осцилляция наших часов превратится в повторяющиеся структурные паттерны (сегменты), на базе которых можно конструировать регулярные элементы вроде позвонков. Более того, управляя скоростью хода часов, природа может регулировать периодичность паттернов и размер сомитов. У разных животных часы идут с разной скоростью. Например, быстрые клеточные часы позволяют змеям формировать множество позвонков.

Теперь нам многое известно о конкретных участниках создания часов и градиентов морфогенов¹⁷. В этих процессах, особенно в схеме осцилляции, задействовано сразу несколько генов, и часть из них кодирует белки, взаимодействующие с регулятором латерального торможения Notch. Активность Notch то возрастает, то снижается; к тому же этот белок помогает соседним клеткам поддерживать синхронность. Notch – ярчайший символ склонности природы к использованию удивительно узкого набора молекул в самых разных контекстах. (Шутка, известная уже не один десяток лет, утверждает, что существует два типа исследователей биологии развития: те, которые изучают сигнализацию Notch, и те, которые не знают, что изучают сигнализацию Notch¹⁸.)

Градиенты и пороги, контактные сигналы и останавливающиеся часы – далеко не единственные физические мотивы, лежащие в основе эмбрионального развития. Клетки мигрируют, растягиваются, удлиняются, складываются друг на друга, меняют способность к адгезии и делают еще много чего другого, без устали придавая форму живой глине растущего эмбриона. Открывая новые стратегии эмбриогенеза, мы все больше восхищаемся трансформациями, которые каждый из нас претерпевает на пути от одной клетки к сложному животному, но заодно и расширяем наши возможности влиять на трансформации, идущие не так и вызывающие врожденные дефекты и рак.

Убеждать Ханса Дриша в том, что биология все же поддается научному познанию, слишком поздно, но можно хотя бы убедить друг друга не отказываться от исследований в этой области. Пусть мы пока и не знаем всего, но можем с полной уверенностью утверждать, что эмбриогенез не противоречит законам физики, а служит прекрасным примером того, как физические свойства и процессы порождают жизненные формы.

Белки растягиваются, даже когда все кажется неподвижным. Внутриклеточные механизмы никогда не пребывают в покое: моторные белки (см. главу 2) перемещаются, компоненты цитоскелета растут и сокращаются – да и вся клетка постоянно вытягивается. Сети внеклеточного матрикса не активничают, однако их жесткость определяет силу, равную и противоположно направленную той, с которой они невольно действуют, и задает тем самым натяжение чувствительных связующих с податливой структурой.

Механические сигналы и вещественные характеристики окружения формируют часть регуляторной схемы жизни и закладываются в решения, принимаемые клетками в ходе самосборки. Изучить процессы в деталях непросто, но в новейших исследованиях вырисовывается их общий вид. Рассмотрим вашу кожу, слоистую ткань, которая постоянно теряет поверхностные клетки и восполняет потери благодаря стволовым клеткам, залегающим в глубине. Когда кожа надолго растягивается, в ней образуются дополнительные клетки – создается больше кожи. Эта реакция способствует не только решению кожей ее повседневных задач, но и благоприятным исходам пластических операций.

Чтобы понять, как это работает, группы Бенджамина Саймонса из Кембриджского университета и Седрика Бланпена из Брюссельского свободного университета исследовали мышей, которым под кожу вводили расширяющийся гель⁵. Ученые обнаружили, что растяжение кожи приводит к усилению экспрессии генов, которые кодируют моторный белок и белки, участвующие в клеточной адгезии и формировании нитей цитоскелета. Кроме того, растяжение учащало деление стволовых клеток и увеличивало долю их стволовых потомков, готовых производить еще больше кожи. Связующим звеном между растяжением и выбором клеточной судьбы служили специфические факторы транскрипции, которые ученые смогли идентифицировать. Когда мышей лишали этих факторов, стволовые клетки переставали реагировать на растяжение кожи. Пока неясно, как эти регуляторные белки связаны с динамикой цитоскелета, но мы хотя бы начинаем находить отдельные фрагменты мозаики и можем надеяться, что дальнейшая разработка этой темы приведет, например, к совершенствованию методов лечения, требующих ускоренного восстановления кожи.

Жесткость не единственная физическая характеристика, которую клетки принимают в расчет в ходе развития. Мы состоим как из твердых, так и из жидких веществ. Кровь циркулирует по артериям и венам, и этот поток жидкости может подталкивать стволовые клетки к превращению в клетки, выстилающие кровеносные сосуды⁶. Все наши ткани, органы и внутренние пространства обладают специфическими жесткостью, вязкостью, эластичностью и другими физическими характеристиками, возникающими в прочной связке с развитием их клеточной архитектуры. Пока мы пытаемся глубже понять это сопряжение, заметно прогрессируют подходы к конструированию многоклеточных структур, чему сильно способствует стремительное расширение знаний о роли физической среды в развитии органов.

Если вам нужно новое сердце, почему бы его не вырастить? Мечта об органах, растущих в «чане» (биореакторе) и самостоятельно принимающих нужную форму, подобно фруктам в саду, невероятно привлекательна. Представьте, что вы можете заменить поврежденный глаз новым – вероятно, даже выращенным из ваших же клеток – или получить вместо раздробленного пальца орган из плоти и кости, а не чуждый телу протез. Помимо починки повреждений, сборка органов вне тела позволила бы нам изучать их развитие и испытывать лекарства без практических и этических затруднений, свойственных исследованиям органов внутри животных. Хотя наша реальность по-прежнему далека от такого наброска будущего, мы стремительно ускоряемся на этом пути, особенно преуспевая в отношении самособирающихся кластеров клеток – органоидов – и частично собираемых человеком органов на чипе.

Мы уже не один десяток лет выращиваем в лабораториях клетки животных (а также растений и грибов). Многое из того, что мы знаем о клеточной биологии – в том числе о структуре и динамике цитоскелета и о транспортировке грузов, – нам поведали как раз такие «культивируемые» клетки. Однако традиционно их наращивают в двумерном пространстве: размножающиеся клетки распределяются по чашке Петри, гелевой пластине или иной плоской поверхности, омываемые питательным бульоном.

Очевидно, такой подход не лишен ограничений. Слой клеток сердечной мышцы может ритмично растягиваться и сжиматься, но при этом не может сформировать такие, как в сердце, трубки и камеры. И объясняется это не только плоской геометрией. Как вы помните из прошлой главы, клеточные решения часто зависят от конфигурации контактов с соседями и градиентов морфогенов, но в двумерной и трехмерной средах эти характеристики различаются. Молекулярные, химические и механические сигналы трехмерной среды выступают важнейшими факторами в развитии органа.

Неестественность двумерных клеточных формирований стала очевидной больше века назад, и почти с тех же пор ее пытались преодолеть. Упомянутый в прошлой главе Росс Гаррисон в 1906 году сообщил, что вырастил нервные волокна в свернувшейся капле лимфы, поместив в нее фрагмент ткани лягушачьего эмбриона. В последующие десятилетия ряд исследовательских групп показал, что эмбрионы разных биологических видов можно разделять на клетки, которые, получив свободу в трех измерениях, способны собираться в агрегаты, воспроизводящие некоторые черты нормального зародыша⁷.

Со временем ученые поняли, что для функционирования клеток критически важна белково-углеводная сетчатая структура за их пределами – внеклеточный матрикс: он не только служит каркасом для органов и тканей, но и поставляет механические и химические сигналы, управляющие экспрессией генов и даже клеточными судьбами. В 1980-х, например, группа Мины Бисселл из Национальной лаборатории им. Лоуренса в Беркли (Калифорния) вырастила ткани молочной железы, способные выделять молоко под контролем соответствующего матрикса, наглядно этим показав, что полученные кластеры клеток не только выглядели, но и работали как положено. С помощью растущего арсенала методов трехмерного культивирования ученые затем начали выращивать и другие ткани, включая опухолевые. Эта отрасль получила сильный импульс к развитию в XXI веке, когда наши представления об основополагающих механизмах онтогенеза дополнились представлением об идеальных «семенах» для выращивания тканей – стволовых клетках.

Комбинируя техники манипуляций со стволовыми клетками и методы трехмерного культивирования, мы получаем поразительное разнообразие работоспособных самоорганизующихся клеточных ансамблей практически любого типа, по замыслу приближающихся к тем самым «органам в чане». Такие ансамбли называют органоидами вне зависимости от того, происходят они от стволовой клетки или нет⁸. Клетки, которые отшелушиваются со стенки вашего кишечника, заменяются потомками стволовых клеток, залегающих на дне миллиардов эпителиальных углублений, или крипт. В 2009 году группа Ханса Клеверса из нидерландского Утрехта показала, что единственная стволовая клетка кишечника, должным образом выращенная в трехмерном матриксе, может породить целое клеточное сообщество в форме неровного шара с четко определяемым внутренним пространством, ограниченным теми же типами клеточных поверхностей, что и реальный просвет кишки⁹; на дне маленьких кармашков оболочки находились стволовые клетки (на рисунке они темные).

Иными словами, стволовая клетка кишечника создает органоид, похожий по форме и поведению на реальный орган достаточно, чтобы использовать его, например, в испытаниях препаратов для лечения болезней кишечника.

Что касается глаз, Ёсики Сасаи и его коллеги из японского Института физико-химических исследований (RIKEN) вырастили из стволовых клеток, превращающихся в клетки сетчатки, органоиды в форме почти полусферического впячивания, характерного для зарождающегося глазного бокала (задней части глаза)¹⁰.

За несколько лет до этого, в 2008 году, та же группа показала, что из стволовых клеток мыши можно вырастить клубки взаимосвязанных нейронов, напоминающие по структуре область коры мышиного мозга¹¹. В 2013 году венская лаборатория Юргена Кноблиха, входящая в состав Австрийской академии наук, вырастила «церебральные органоиды», воссоздающие несколько слоев головного мозга с функциональными нейронами и областями, которые напоминали зарождающиеся структуры вроде префронтальной коры, гиппокампа и других¹². Хоть этим органоидам и было далеко до рабочего мозга, им сразу же нашлось применение. Команда Кноблиха пыталась выяснить природу микроцефалии – расстройства развития, приводящего к формированию слишком маленького мозга, – и в качестве основы для органоида использовала стволовые клетки человека с этим диагнозом. По сравнению с аналогами, выращенными из клеток здоровых людей, в этих органоидах один тип стволовых клеток претерпевал меньше делений, что выливалось в общий дефицит клеток. Хотя возможность обретения церебральными органоидами чувств или сознания весьма призрачна, ученые и философы уже прощупывают этическую компоненту таких исследований, включая критерии оценки и трактовки способностей нейронных ассоциаций¹³.

Кишки, глаза, мозги… Полный список созданных органоидов гораздо длиннее и продолжает расти. Как отмечалось, органоиды служат великолепными инструментами, позволяющими использовать совершенно новые подходы в изучении индивидуального развития, болезней и лекарств, поскольку это подобия реальных органов, не заключенные в живых телах и способные строиться из человеческих клеток. Можно даже помечтать, что технологический прогресс однажды превратит органоиды в полноценные органы, готовые к пересадке человеческим реципиентам.

Органоиды не только приносят практическую пользу, но и дают нам восхитительный биофизический урок. Мы уже не раз упоминали о самосборке – как в молекулярном масштабе, когда белки самопроизвольно укладываются в уникальные формы, так и в организменном, когда по заложенным внутри них принципам строятся целые тела. Сейчас мы видим, можно сказать, модульную самосборку в средних масштабах, возможную благодаря тому, что компоненты разных органов содержат инструкции по собственной организации. Для наглядности можно представить, что не только автомобиль формируется из маленького зачатка, но и обломок двигателя вырастает в полноценный ревущий мотор, если омывается подходящим моторным маслом и закреплен подходящими деталями, а фрагмент водительского сиденья превращается в целое кресло при заботливой поддержке – иными словами, каждый компонент целого в какой-то степени самодостаточен. Природа эксплуатирует самосборку на всех уровнях организации, ступень за ступенью.

Мы помогаем самосборке органоидов, конструируя подходящий внеклеточный матрикс, но после этого пускаем дело на самотек. А что, если бы мы принимали более деятельное и целенаправленное участие в работе самих внеклеточных механизмов? Создание малых объектов, не предназначенных для биологического применения, стало одним из величайших триумфов человеческой цивилизации за последние полвека. Так, наши заводы поразительно быстро и надежно штампуют чипы, ведущие вычисления внутри мобильного телефона, с миллиардами транзисторов, втиснутых в несколько квадратных сантиметров. Наши микропроизводственные возможности гораздо шире набора электродеталей вроде диодов и транзисторов. Применяя пластмассы и гели, например, мы можем мастерить канальцы, стыковочные узлы, клапаны и насосы субмиллиметрового масштаба – как раз то, что нужно для доставки питательных веществ и сигналов группам клеток.

Сочетая микропроизводство с культивированием клеток, мы получаем «органы на чипе», разнообразие которых, как и в случае органоидов, поразительно быстро растет. Несколько из них появились на свет в лаборатории Дональда Ингбера в Институте биологической инженерии Висса при Гарвардском университете. В частности, в 2010 году там создали «легкое на чипе»¹⁴. В этой конструкции пористая, мягкая, тончайшая силиконовая мембрана разделяет две камеры, одна из которых наполнена воздухом, а другая – водным раствором, напоминающим кровь. Как мы увидим в главе 11, легкие по своей сути – это место соприкосновения воздуха и воды, где происходит газообмен. По одну сторону мембраны ученые вырастили клетки того типа, который выстилает воздушную сторону легочного интерфейса, а по другую – клетки выстилки кровеносных сосудов. Хитрость же была в том, что торцы мембраны упирались в тонкие стенки камер, приспособленных для закачки и откачки воздуха. Под давлением воздуха стенки сжимали мембрану с наросшими на ней слоями клеток, под вакуумом – растягивали (см. рисунок).

Так получилось устройство, воссоздающее не только структуру, но и динамику легких – способное растягиваться и сжиматься, если нам хочется, в том же ритме, что и при естественном дыхании. Камеры, мембраны, клапаны – все это создано методами микропроизводства, способными покрывать чип мозаикой псевдолегких, и все можно увидеть в микроскоп. Ингбер с коллегами показал, что поглощение взвешенных в воздухе частиц через клеточную стенку – важная проблема и при загрязнении воздуха, и при доставке лекарств – усиливается периодической механической пульсацией клеточных мембран.

В последующие годы на чипе научились создавать сердца, почки, желудки, кожу и многое другое и даже нашли способ связывать воедино разные органы – конструировать названные слишком громко, но все равно впечатляющие «тела на чипе»¹⁵. Клеточные культуры в таких системах по большей части двумерны, и нам еще только предстоит объединить трехмерную самосборку органоидов из стволовых клеток с флюидикой и механическими каркасами органов на чипе.

Полуискусственные конструкции выращиваемых в лаборатории стволовых клеток, органоидов и органов на чипе позволяют нам изучить восхитительные феномены многоклеточной организации. Пока, однако, мы рассматривали клетки тела, принадлежащие одному биологическому виду. В следующей главе мы увидим, что на самом деле все устроено гораздо сложнее: в нас ведь обитает множество микробов.

Однако максимум общественного внимания приковывает другой аспект кишечной микробиоты – связь между ее составом и широким спектром хронических заболеваний. Именно он закрепил понятие «кишечные бактерии» в семейной, новостной и рекламной повестках. Известно, что такие разные болезни, как сахарный диабет, воспалительные заболевания кишечника, опухоли желудочно-кишечного тракта и даже неврологические патологии, включая рассеянный склероз и болезнь Паркинсона, сопровождаются изменением состава микробных сообществ в кишечнике больных по сравнению со здоровыми⁴. Эти различия не ограничиваются представленностью одного-двух видов. В отличие от «классических» заболеваний вроде туберкулеза (вызываемого бактерией Mycobacterium tuberculosis) и бубонной чумы (вызываемой бактерией Yersinia pestis), при развитии этих куда более загадочных недугов почему-то серьезно меняется численность десятков или даже сотен микробных видов.

Разумеется, корреляция не равна причинности. Сложно установить, относится ли аномальная структура микробного сообщества к симптомам заболевания или же способствует его развитию, причем эти варианты не исключают друг друга. Так или иначе, даже возможность того, что характеристики микробных популяций влияют на появление и течение изнуряющих заболеваний, подстегивает исследования, направленные на проработку подобных связей и, хотелось бы надеяться, на поиск способов сознательного воздействия на кишечную экосистему ради поддержания здоровья и борьбы с болезнями.

При некоторых нарушениях, кажется, уже удалось показать причинно-следственную связь между кишечными бактериями и состоянием здоровья. Так, рецидивирующий псевдомембранозный колит, часто вызываемый бактерией Clostridium difficile, оказался восприимчив к лечению трансплантацией фекальной микробиоты. Как следует из названия, эта процедура предполагает перенос кала здорового донора пациенту с целью наводнить его аномальное микробное сообщество «нормальными» иммигрантами[39]. Трансплантация фекальной микробиоты показала обнадеживающую эффективность в лечении воспалительных заболеваний кишечника и некоторых других состояний, но результаты пока сильно разнятся⁵. Слово «трансплантация» в названии процедуры отсылает нас к трансплантации органов не случайно. Кишечный микробиом по сути своей и есть орган, который выполняет физиологическую функцию в организме своего хозяина, хоть и состоит не из его собственных клеток.

Эти специфические аспекты здоровья поднимают множество вопросов. Можно ли заменить «фекальную» компоненту трансплантации кишечной микробиоты таблеткой с тщательно подобранным видовым составом, чтобы снизить вероятность случайного заражения пациента вредными бактериями при пересадке и одновременно сделать терапию эстетичнее? Нужно ли вообще помещать в такую таблетку бактерии или же достаточно одних питательных веществ, предпочитаемых видами, численность которых мы хотим нарастить? (Эти вопросы подстегивают развитие целой отрасли – производства про– и пребиотиков.) Что такого делают бактерии, что влияет на здоровье их хозяина? И как здоровье хозяина влияет на них? Как мы можем нарушить – а может, даже «перезагрузить» – кишечный микробиом?

Ответов на перечисленные вопросы у нас пока нет. Область исследований микробиомов невероятно захватывающая и динамичная. Порядка в ней, однако, мало. Помимо настоящих научных бриллиантов там полно противоречивых, неубедительных и безосновательно раскрученных исследований. Как на Дикий Запад, в эту область устремляются авантюристы и охотники за удачей, хорошие и не очень, а законы и здравый смысл появляются позже. К такому хаосу приводит множество факторов. Во-первых, как уже упоминалось, кишечный микробиом крайне изменчив. Утверждение Толстого «Все счастливые семьи похожи друг на друга, каждая несчастливая семья несчастлива по-своему»[40] неплохо подходит к обычным органам. Например, все здоровые, «счастливые» сердца схожи анатомически и ритмичностью сокращений. Структурные аномалии и аритмичные электрические сигналы мы даже можем считать надежными индикаторами нездоровья. Кишечный микробиом, напротив, не имеет стандартного списка членов. Даже у здоровых людей его состав сильно разнится, и перед нами встает непростая задача найти совсем не очевидные статистические признаки, отделяющие здоровье от болезни.

Во-вторых, анализ кала, каким бы полезным он ни был, предоставляет нам лишь косвенную информацию о микробном населении кишечника. Строго говоря, он показывает лишь, кого там нет, и довольно смело считать его индикатором всего остального. В одном изобретательном эксперименте ученые под руководством Эрана Сегаля и Эрана Элинава из Института Вейцмана в Израиле сравнили микробиомы из фекальных проб с добытыми в ходе инвазивной процедуры колоноскопии и обнаружили в них явные различия – как у людей, так и у мышей⁶. В том же исследовании людям и мышам давали пищевые добавки с широко представленными на рынке бактериями-пробиотиками и наблюдали весьма ограниченную и переменчивую колонизацию кишки этими «желательными» микробами. Изучать, что поступает в кишечник и что выходит из него, относительно легко, но это может слишком мало сообщать нам о том, что находится в самом кишечнике, и мы по-прежнему не сможем разобраться в его микробиоме.

В-третьих, проводить контролируемые эксперименты, четко отделяющие причины от следствий и значимые изменения от случайных колебаний, непросто. Наша еда служит источником питательных веществ, которые действуют на разные микробы по-разному. Зайдя в любую комнату, мы можем повстречать новых микроорганизмов. Избавиться от подобных возмущающих факторов вряд ли возможно. Нельзя вырастить большие группы людей, которые не отличались бы друг от друга ничем, кроме структуры кишечного микробиома, и наблюдать, как у них развиваются всевозможные болезни и расстройства. Но точно так же нельзя сравнивать и естественные группы вроде населения разных регионов, не сомневаясь, что различия в здоровье объясняются качествами их кишечных микробов, а не сочетанием множества других переменных.

В экспериментах с животными мы можем контролировать гораздо больше. Мышей, рыбок и многих других можно выращивать «стерильными», то есть не заселенными никакими микробами, и либо поддерживать их в таком состоянии, либо знакомить со строго определенными видами микроорганизмов. Такие исследования показывают, что стерильные животные (гнотобиоты) во многом отклоняются от нормы, а резидентные микробы играют важнейшую роль в обучении и стимуляции иммуноцитов, размножении клеток кишечной выстилки и других процессах⁷. Благодаря строгому контролю в нескольких экспериментах удалось открыть особые химические факторы, которыми микробы воздействуют на хозяев. В лаборатории Карен Гиймен, моей коллеги по Орегонскому университету, одной из первых освоившей работу с безмикробными данио-рерио, обнаружили, что в стерильных личинках рыб не хватает производящих инсулин бета-клеток поджелудочной железы⁸. Этот дефект устранялся либо бактериальной колонизацией, либо введением особого белка, который секретируют некоторые кишечные бактерии. У людей диабет I типа связан как раз с разрушением бета-клеток, и находка в эксперименте с данио-рерио может указать нам на немыслимые прежде подходы к их восстановлению.

Удалось установить причастность микробиома к формированию ряда других органов и тканей – например, к росту костей у мышат⁹. Очевидно, кишечные бактерии настроили разные каналы коммуникации с хозяином, который, в свою очередь, прислушивается к своим микробам, особенно в вопросах направления развития на ранних этапах жизни. Это несколько удивляет: казалось бы, развитию животного рискованно зависеть от партнерства с неживотными созданиями, да еще с такими капризными и непостоянными, как бактерии. С другой стороны, животные эволюционировали в мире, уже населенном микробами. Раз избегать их невозможно, вероятно, положиться на бактерий было не опаснее, чем на законы физики. Последнее заявление спорно – я даже сомневаюсь, что могу поверить в такое, – но справедливости ради хочу сказать, что наши представления о развитии животных меняются под натиском новой информации о микробных сообществах.

Но теперь я вернусь к пессимизму, который выказал чуть выше, и отмечу, что выращивать гнотобиотов довольно сложно. Мыши могут оставаться стерильными до достижения зрелости, но это требует больших усилий и затрат. Работать с данио-рерио проще, но все равно нелегко: и моя лаборатория, и лаборатории моих коллег постоянно сталкиваются с проблемами, поскольку бактерии и грибы не упускают ни малейшей возможности проскочить в стерильную рыбу. Кроме того, данио-рерио не могут оставаться стерильными до зрелости (по крайней мере сейчас), поскольку полноценное питание в их случае предполагает живой корм, а он неизбежно приносит с собой микробы. Поэтому значительная часть раскрученных исследований, особенно на мышах, делает выводы на основе выборки от силы из десятка особей. Это примерно как прогнозировать исход национальных выборов на основе опроса десятка избирателей: изменчивость и сложность системы требуют анализа гораздо более многочисленных групп.

По этим и иным причинам многие открытия, связанные с микробиомом, не столь убедительны, как хотелось бы. Например, сегодня, спустя 10 лет с момента сообщения о связи между ожирением и составом кишечного микробиома человека, эта связь уже не кажется такой прочной¹⁰. Нельзя сказать, что ее нет вовсе: кишечные микробы, несомненно, участвуют в усвоении жиров и многих других пищеварительных процессах, которые, в свою очередь, тесно связаны с развитием ожирения. Однако роли столь разнообразных микроорганизмов не так просты, как хотелось бы. Подобные трудности возникают и с другими признаками, призванными отделить здоровье от нездоровья. Может показаться странным, что наука не застрахована от таких промахов. И все же множество ученых из разных областей все пристальнее и пристальнее следят за воспроизводимостью результатов.

Впрочем, моя задача не в том, чтобы исчерпывающе описать все, что нам известно либо не известно о кишечном микробиоме, и не в том, чтобы проанализировать структурные проблемы современной науки, хотя обе темы страшно привлекательны. Я здесь хочу ответить на вопрос, может ли биофизический подход помочь нам разобраться в кишечном микробиоме. Любопытно, например, выяснить, пригодна ли концепция самосборки для постижения архитектуры бактериальных колоний и актуальны ли общие стратегии бактериальной навигации в замкнутом, бурлящем пространстве кишечника.

К сожалению, неопределенности в этой сфере пока больше, чем в любой из тех, что мы уже затрагивали: изучение нашей кишечной экосистемы далеко от завершения. Именно им главным образом и занимается моя лаборатория в Орегонском университете, поэтому я расскажу не только о возможных общих принципах, но и о том, как бросил почти все остальные исследования ради поиска физики в загадочной субстанции кишечного микробиома.

Надо признать, решение мое было странным. Я физик по образованию и занимаю профессорскую должность на кафедре физики. Как мы видели, физика не сводится к магнитам, кваркам и лазерам, а пронизывает и живую природу, но даже биофизикам не очевидно, как связать ее с беспорядком кишок, таким непохожим на отточенность хореографии фолдинга белка и механистичность законов упаковки ДНК. Зачем мне – и небольшому, но растущему числу других биофизиков – делать ставку на биофизику микробиома как на предмет, заслуживающий изучения?

Представьте себе тропический лес, изобилующий растениями и животными. Если бы вы слышали, что в нем обитают организмы, называемые обезьянами, леопардами, слонами и деревьями, но почему-то были не в курсе, что деревья стоят на месте, обезьяны лазят по деревьям, а слоны к этому не склонны, что леопарды охотятся на обезьян, но слонов обходят, – если бы вы не знали ничего о поведении, местоположении, размере и подвижности лесных организмов, вам не стоило бы даже пытаться рисовать достоверную картину работы лесной экосистемы. Не знай вы, что на каменистом берегу дважды в сутки случается прилив, что морские звезды – подвижные хищники, а морские львы заплывают туда перекусить, вам было бы не легче разобраться в экосистеме приливной зоны, сколько бы ДНК ее обитателей вы ни соскребли со скал и ни вычерпали из морской воды. Для макроскопических систем это кажется очевидным, но вообще-то принцип важности структуры и динамики универсален.

И все же, как упоминалось выше, информацию о кишечном микробиоме мы получаем в основном с помощью секвенирования ДНК, которое не учитывает его структуру и функции. Такой дефицит биофизических знаний начал беспокоить меня лет десять назад, когда в мире резко возрос интерес к кишечной микробиоте и я частенько беседовал с уже упомянутой Карен Гиймен. Примерно тогда же я увлекся новыми методами микроскопии, особенно флуоресцентной микроскопией плоскостного освещения (LSFM), которая позволяет быстро получать трехмерное изображение больших полей обзора (в микроскопии большими считают поля диаметром чуть меньше миллиметра). В итоге моя группа сконструировала собственный LSF-микроскоп и начала изучать кишечник живой личинки данио-рерио. Мы понимали, что сможем получить изображения и видео, охватывающие весь кишечник и достаточно четкие, чтобы разглядеть отдельные бактерии. Никто прежде не проводил такую визуализацию позвоночных. Пользуясь преимуществами оптической прозрачности личинок и возможностью выращивать их стерильными, мы позволяли безмикробным рыбам вступить в контакт не более чем с двумя видами микроорганизмов, чтобы без лишних сложностей изучать, как организуются и ведут себя новоселы.

Я рассудил, что, если бы нам не повезло, мы обнаружили бы лишенные отличительных черт скопления бактерий, одинаковые для всех видов и такие же, как в лабораторной пробирке. Тогда мы, возможно, занялись бы измерением скорости роста кишечных бактерий или другим довольно скучным, но потенциально полезным делом.

К счастью, Природа оказалась к нам благосклонна. Первые же микроскопии явили нам поразительное многообразие форм. Одни бактерии плавают свободно, другие сбиваются в группы. Одни предпочитают передний отдел кишечника, другие заселяют в основном задний. Наметились даже очевидные кандидаты в носители физических характеристик, влияющих на работу кишечной экосистемы, что может подкинуть нам идеи, как манипулировать межвидовой конкуренцией и кооперацией микробов.

Почти во всех экспериментах с личинками данио-рерио наша лаборатория использует бактерии – аборигены кишечника этой рыбы. Но в качестве начальной виньетки, иллюстрирующей физические предпосылки динамики микробиома, я опишу эксперимент не с аборигенной, а с патогенной бактерией – холерным вибрионом. Vibrio cholerae активно изучается больше 100 лет, и хотя холера сегодня не опустошает города, как пару веков назад, она все же уносит около 100 тысяч жизней в год¹¹. Я практически и не думал об этой инфекции до одной необычной встречи в «Биосфере-2» – лаборатории, где в начале 1990-х безуспешно пытались создать герметичную экспериментальную экосистему, способную существовать автономно. Там я пообщался с микробиологом Брайаном Хаммером из Технологического института Джорджии и специалистом по микробиому Жуаном Шавьером из Мемориального онкологического центра Слоуна – Кеттеринга в Нью-Йорке. Нет, нас не заперли в бетонном бункере и не заставили выращивать себе пропитание, а просто пригласили на семинар, организованный Исследовательской корпорацией развития науки, небольшой частной компанией, финансирующей научные проекты. («Биосфера-2» теперь туристический объект и площадка для конференций при Аризонском университете, который совмещает все это с проведением экспериментов в уже не герметичных зданиях под стеклянными крышами.) В ходе бесед мы поняли, что все еще мало знаем о средствах, помогающих холерному вибриону освоиться в человеческом кишечнике. Бактерия ведь не вплывает в пустое пространство, а попадает в орган, густонаселенный триллионами резидентных микроорганизмов, среди которых она должна как-то закрепиться.

Брайан много лет изучал поразительный инструмент, которым обладают V. cholerae и многие другие микробы, – шприцеподобное устройство под названием система секреции VI типа (T6SS)¹². С помощью этой наномашины бактерии прокалывают соседние клетки и впрыскивают в них токсины[41]. Нас заинтересовало, может ли V. cholerae использовать T6SS для внедрения в кишечник и позволит ли наша комбинация LSF-микроскопии и личинок данио-рерио пролить на это свет. Кроме того, никто никогда не наблюдал, как холерный вибрион колонизирует кишку животного и как вступает в конкуренцию с резидентными бактериями, – вдруг мы увидим нечто захватывающее? Группа Брайана создала несколько штаммов V. cholerae, включая вариант, в котором гены T6SS всегда оставались включенными, а следовательно, вибрион всегда был готов прокалывать соседей (слева на рисунке); у другого варианта «шприц», наоборот, был дефектным, и бактерия не могла никого атаковать (справа).

Группа Жуана проводила эксперименты в чашках Петри, чтобы изучить и визуализировать убийство бактерий бактериями – действо вообще-то довольно красивое. Ну а мы заглядывали внутрь рыбы¹³.

В простейшем эксперименте по заражению кишечника мы заранее колонизировали стерильную рыбу единственным аборигенным видом бактерий и через 24 часа ввели в окружавшую ее воду один из штаммов V. cholerae. В случае заражения вибрионом с поврежденной системой секреции аборигенные бактерии в кишечнике выглядели так же, как если бы пребывали в одиночестве: они не теряли в численности и формировали плотные колонии. После вторжения захватчика, всегда готового к атаке, аборигенные бактерии гибли: за сутки их популяции сокращались в среднем в 100 с лишним раз, а то и вовсе исчезали. Мы наблюдали, как аборигены теряли контроль над территорией и их колонии перемещались по кишечнику все ниже и ниже, пока не изгонялись из рыбы полностью. На том этапе мы страшно обрадовались очевидной разнице в результатах действия и бездействия T6SS и предположили, что вооруженные холерные вибрионы уничтожают аборигенов, вытесняя их из кишечника. Но мы продолжили наблюдения и обратили внимание на действия самих данио-рерио. Кишечник рыб, как и ваш, периодически сокращается, чтобы перемешивать и продвигать содержимое. Магистрантка Саванна Логан, проводившая эксперименты, заметила, что у рыб, колонизированных всегда боеспособными вибрионами, кишечник сокращался гораздо интенсивнее, чем у стерильных сородичей и рыб, колонизированных любыми другими штаммами V. cholerae. Анализ изображений показал, что интенсивность сокращений у рыб, колонизированных вибрионом с постоянно активной T6SS, была примерно на 100 % выше. Напрашивался вывод, что бактерии атакуют скорее не своих конкурентов, а их хозяина.

Чтобы это доказать, мы снова обратились к сочетанию генной инженерии с микроскопией. Было известно, что фрагмент одного из белков в составе бактериального «шприца» токсичен для микробов-эукариот типа амеб, например, поскольку разрушает филаменты цитоскелета, свойственные всем эукариотическим клеткам, но не представленные в идентичных вариантах у бактерий. Группа Брайана Хаммера создала дополнительный штамм V. cholerae, формирующий в целом функциональный шприц, только без этого токсичного фрагмента. Повторив тот же опыт с заражением рыбы, мы увидели нормальные кишечные сокращения и нормальную, стабильно высокую численность аборигенных кишечных бактерий. Следовательно, холерный вибрион побеждал бактериальных конкурентов, не убивая их, а выдворяя целыми ассоциациями из хозяина с помощью усиления кишечной моторики, обусловленного раздражением стенок токсичными шприцами. Для самих V. cholerae обстоятельства складывались удачнее, поскольку они не склонны к агрегации, подвижны и индивидуалистичны. Так мы установили, что любая бактерия может манипулировать физиологией животного, используя свои шприцеподобные системы. В более широком масштабе наша работа подчеркнула, что физический ландшафт кишечника критически важен для регуляции кишечного микробиома, причем механизмы этого влияния непознаваемы с помощью одних лишь экспериментов в пробирке и анализа ДНК.

Помогут ли наши находки победить холеру? Сомневаюсь. Разумеется, традиционным был бы ответ «да», ведь именно он должен звучать в любых новостях и пресс-релизах; в крайнем случае ответ обязан подводить к мысли, что не за горами победа над любыми болезнями, хоть как-то касающимися открытия. Но в случае с холерой есть препятствие помощнее, чем длинная и непредсказуемая тропинка от фундаментальной лабораторной науки до клинической практики: холеру и без того легко лечить. И главное средство здесь – за исключением самых тяжелых случаев – вода с солями и сахарами. Пугающе высокая смертность от этой болезни в наши дни свидетельствует лишь о плачевном состоянии санитарии и вообще общественного здравоохранения во множестве стран. Зачем же нам тогда изучать у холерного вибриона систему секреции VI типа? Она, конечно же, интересна и сама по себе, но меня больше волнует то, что V. cholerae – лишь один из многих видов бактерий, обладающих таким механизмом. Та же система секреции есть у десятков, а то и сотен видов в вашем пищеварительном тракте, и потому, изучив ее роль в кишечнике, мы могли бы лучше понять, от чего зависит структура вашего микробиома. Научившись манипулировать T6SS у разных бактерий, мы, возможно, проложили бы долгожданный путь к оздоравливающему перекраиванию кишечного микробиома.

Почти во всем, что мы наблюдали в кишке данио-рерио, проявлялся отчетливый биофизический след: физические аспекты поведения – плавание и навигация, формирование трехмерных колоний или манипуляция кишечными сокращениями – во многом определяли исходы. В другом эксперименте мы обнаружили, что под действием малых доз широко применяемого антибиотика обычно подвижные бактерии удлиняются и спутываются, а склонные к агрегации формируют более крупные кластеры, но в меньшем количестве. Оба сценария ведут к значительному общему сокращению бактериальной популяции, поскольку слишком уж сплоченные микробы выталкиваются усилиями кишечника. Вероятно, так и объясняются загадочные крупные изменения в кишечном микробиоме человека, запускаемые антибиотиком и выявляемые с помощью секвенирования. Но это-то и тревожит больше всего, ведь антибиотики в низких концентрациях – повсеместно распространенный загрязнитель. Этот проект, как и многие другие, мы выполняли вместе с лабораторией Карен Гиймен, а основное бремя экспериментов лежало на аспиранте-физике Брэндоне Шломанне и постдоке-биологе Трэвисе Уайлсе, с готовностью размывавших границы между науками.

Наблюдать за поведением бактерий прекрасно, но управлять ими, должно быть, еще лучше. И снова мы обращаемся к одной из наших красных нитей – к теме регуляторных цепей. В главе 4 мы познакомились с инструментами активации и инактивации отдельных генных цепей (вспомните мышей, меняющих цвет). Вышеупомянутый Трэвис Уайлс внедрил подобные переключатели в геном аборигенной кишечной бактерии данио-рерио и взял в свои руки контроль над ее плаванием и химической чувствительностью. Чтобы перемещаться в жидкости, эти бактерии вращают торчащим из одного конца клетки «хвостиком» – жгутиком наподобие штопора. Жгутик и его мотор строятся самосборкой множества разных белков, включая пару PomA и PomB в составе статора мотора (отмечены черным на рисунке основания жгутика). Без PomA и PomB нить жгутика формируется нормально, а вот мотор не создает крутящего момента, который вращал бы жгутик и за счет этого двигал клетку. Следовательно, переключатель, который под влиянием химического сигнала извне выключает гены pomA и pomB в бактерии, обычно экспрессирующей их, либо включает эти гены в бактерии, обычно их не задействующей, позволяет нам решать, будут ли модифицированные микробы плавать в кишечнике. (В нашем случае внешний сигнал должен быть постоянным, сродни кнопке, на которую надо непрерывно давить, чтобы свет не погас. Получается, положения этого переключателя не записываются в память – инженер назвал бы его переключателем мгновенного действия.)

Переключатель позволяет нам узнать больше, чем варианты с простым удалением или постоянной активацией генов. Так, если мы вырежем у бактерий гены, причастные к подвижности, и не найдем этих бактерий в кишечнике, то будем вынуждены выяснять: плавание – это способ удерживаться в кишечнике или прежде всего способ добираться до рыбы и колонизировать ее? Отключение тех или иных моделей поведения после колонизации позволяет нам обозначить роли изучаемых бактерий в специфических сценариях кишечной жизни. Отключение подвижности, как мы обнаружили, приводит к значительному сокращению популяции модифицированных микробов, поскольку они не в силах противостоять кишечным течениям, выносящим их из рыбы, и не могут размножаться так быстро, чтобы восполнять потери. Еще удивительнее, что само животное чувствует эти поведенческие нюансы. У данио-рерио, запрограммированных на производство зеленого флуоресцентного белка при каждой активации сети генов иммунитета, мы наблюдали мощный иммунный ответ на колонизацию рыбы нормальными, подвижными бактериями (как нам и подсказывали прежние наблюдения) и очень слабый ответ на заселение бактериями, неспособными плавать¹⁴. Разницу нельзя было объяснить связью иммунных клеток с поверхностными белками микробов, так как внешний вид бактерий не менялся. Мы заподозрили, что критична именно подвижность, поскольку она позволяет бактериям подбираться ближе к стенкам кишечника и контактировать с чувствительными клетками. Это еще нужно доказать, но в любом случае мы полагаем, что в смысле управления экосистемой поведение бактерий в кишечнике играет не меньшую роль, чем поведение животных в лесу.

Потенциал инженерии генетических схем волнует не только нас. Многие ученые уже поняли, что микробы могут «запоминать» условия в кишечнике и после прохождения по нему своим состоянием показывать, встречались ли у них на пути определенные токсины, питательные вещества и другие химические соединения¹⁵. В составе одной схемы с генными цепями, производящими особые биохимические агенты, генетические переключатели могли бы обеспечивать доставку лекарств только при должной стимуляции, используя способность клеток к принятию решений для замены традиционных таблеток более продвинутым лечением.

Но вернемся к изучению микробиома с точки зрения физики: влияние биофизических факторов на динамику популяций кишечных микроорганизмов выявляют и другие научные группы. Например, в лаборатории Теренса Хва на кафедре физики Калифорнийского университета в Сан-Диего сконструировали искусственные устройства, воспроизводящие перистальтику человеческого кишечника, чтобы оценить естественные соотношения численности типичных резидентных бактерий¹⁶. Ким Хён Чон из Техасского университета в Остине[42] создает растяжимые устройства «кишечник на чипе», подобные платформе «легкое на чипе» (см. главу 8), для исследования механики взаимодействий микробов с культивируемыми клетками кишечника¹⁷. Разные научные группы изучают в числе прочего связывание бактерий друг с другом с помощью антител или механические роли тканевого и осмотического стрессов. Но я должен подчеркнуть, что биохимические и генетические характеристики кишечных микробов изучают гораздо чаще, чем физические, и такие исследования особенно хороши для открытия способов общения микробов друг с другом и со своим хозяином. Бактерии могут синтезировать необычные белки, жиры, гормоны, витамины и даже нейромедиаторы. Несомненно, в кишечном микробиоме одновременно действуют биологические, химические и физические принципы.

Самособранная экосистема

Динамику, порождаемую взаимодействием бактериальной архитектуры и кишечной механики, мы можем считать очередным проявлением знакомого нам принципа самосборки. В микробных сообществах возможны более необычные и абстрактные способы самосборки, связанные с общими свойствами экосистем. Как я упоминал, в вашем кишечнике живут представители сотен микробных видов. Изобилие таксонов находят и в ведре морской воды или в ложке земли. Такое многообразие сбивает с толку. Вообще-то это известная загадка экологии, в 1961 году названная зоологом Джорджем Хатчинсоном парадоксом планктона. Представьте себе какую-то абстрактную группу видов, которой доступен единственный тип пищи. Всегда найдется один вид, лучше прочих усваивающий эту пищу и размножающийся; постепенно по численности он превзойдет остальных, и разрыв будет только расти. В конце концов этот вид добьется полного доминирования в среде, превратив ее из многообразной в монокультурную. Если доступно несколько типов пищи, длительно сосуществовать смогут несколько видов. Высокое же таксономическое разнообразие, по идее, возможно лишь в тех экосистемах, где пища невероятно разнообразна и точно соответствует предпочтениям каждого из видов.

Природа, однако, в грош не ставит этот аргумент и вопреки теории постоянно создает и поддерживает какофоническое многообразие. Впрочем, даже теория предлагает множество решений парадокса планктона. Одно из них – пространственная структура: если разные организмы населяют разные зоны, они могут сосуществовать, даже имея одинаковые пищевые предпочтения. Второе – временнáя структура: например, численность популяций может колебаться не синхронно, и тогда виды будут доминировать попеременно. Другие решения связаны с метаболизмом. В простейшей картине, которую мы нарисовали, организм лишь поглощал пищу и размножался. В реальности не обойтись без множества промежуточных шагов. После поглощения одни молекулы преобразуются в другие, расщепляются на элементарные звенья или объединяются. Бактерии, в частности, особенно склонны выделять промежуточные продукты метаболизма в среду или поглощать их из нее. В итоге получается гораздо больше типов молекулярной пищи, чем могло бы показаться при учете лишь начальной или конечной точки. Микробы кормят друг друга в ходе таких химических переговоров. Поэтому бульона с единственным питательным веществом хватает для поддержания жизни десятков бактериальных видов. Несколько лет назад группа Альваро Санчеса в Йельском университете выделила из образцов почвы и листвы сотни микробных сообществ, кормила каждое из них всего одним веществом и показала, что несколько видов могут длительно уживаться друг с другом, причем итоговые составы ансамблей предсказуемы и воспроизводимы¹⁸.

Наши теоретические представления об экологическом разнообразии тоже углубляются, и мы все лучше понимаем, почему подобное сосуществование распространено гораздо шире, чем казалось ранее. Математическими уравнениями можно описать рост, смерть и взаимодействия видов в экосистеме. Вместо того чтобы присваивать параметрам таких моделей конкретные значения, можно изучить диапазон исходов, получаемых при многократной подстановке случайных величин, и составить представление о том, какие свойства с большей или меньшей вероятностью будут присущи экосистеме. И снова мы сталкиваемся с предсказуемой случайностью: вместо того чтобы оценивать средние характеристики случайных блуждающих, мы оцениваем усредненные характеристики моделей случайных экосистем, определяя, например, частоту исходов, в которых остаются все виды или в которых часть видов вымирает. Пионером в применении этой тактики стал эколог Роберт Мэй: в 1970-х он опубликовал очень важную, ставшую классической статью, где заключал, что разнообразие и стабильность в экосистемах не идут рука об руку¹⁹. Напротив, добавление очередного члена в сообщество снижает вероятность устойчивого сосуществования видов. Эту мысль развивают многие теоретики. В Бостонском университете, например, Панкадж Мехта с коллегами показал, что сосуществование возможно и по достижении теоретически выведенной Мэем точки дестабилизации, но только если речь идет об отдельных группах взаимодействующих видов, а не о совокупности их всех²⁰.

Другие теоретические подходы прочерчивают более четкую связь между потреблением питательных веществ и колебаниями численности популяции. Модели, часто объединяемые под названием «потребитель – ресурс», восходят к классическим работам 1960–1970-х, проведенным Робертом Макартуром и другими экологами. Эти модели, в свою очередь, легли в основу того же парадокса планктона. Как мы теперь понимаем, решения этого парадокса могут поступать из разных источников. Чтобы виды со сходными пищевыми предпочтениями могли ужиться вместе, порой достаточно даже не прибегать к обмену метаболитами, а просто ограничить потребление тех или иных веществ. Представьте, что вы можете питаться картофелем, морковью и горохом, но общее количество пищи определяется размером вашей тарелки. Это значит, что увеличение порции картофеля неизбежно компенсируется уменьшением порций моркови и гороха: им на тарелке достанется меньше места. В контексте метаболизма овощи символизируют пищеварительные ферменты, рассчитанные на разные питательные вещества, а тарелка – скорость, с которой организм может вырабатывать ферменты. Нед Уингрин и его коллеги из Принстонского университета обнаружили, что в математическом описании такого ограниченного потребления ресурсов на удивление велик набор параметров, допускающих сосуществование видов, и объясняется это главным образом тем, что есть множество способов умеренного потребления нескольких типов пищи, по общему получению питательных веществ эквивалентных ненасытному поглощению одного-единственного типа²¹.

Область теоретической экологии обширна, и нескольких абзацев явно недостаточно, чтобы описать ее во всей полноте. Мой выбор пал на приведенные примеры не только потому, что они проливают свет на недавние открытия, но и потому, что в них мы в очередной раз наблюдаем перекличку физики и биологии. Методы Роберта Мэя основаны на математике теории случайных матриц, которую физик Юджин Вигнер разработал в 1950-х, чтобы описывать уровни энергии тяжелых атомов, подставляя в уравнения квантовой механики случайные множества параметров, а не трудновычислимые точные значения. Мэй понял, что этот инструментарий можно перенести и на экологические системы. Физики Панкадж Мехта и Нед Уингрин в своей работе постоянно обращаются к теории фазовых переходов и другим физическим системам, чтобы объяснить загадки экологии.

Если вернуться к моей собственной работе, то проведенные в нашей лаборатории эксперименты с данио-рерио убедили меня, что физическая структура и механические силы вносят весомый вклад в динамику кишечного микробиома. У нас не было бы шансов предсказать исходы заражения Vibrio cholerae или реакцию на антибиотики, проводи мы все измерения в чашке Петри. Физическая среда кишечника столь же важна для этой экосистемы, как скалы и приливы для побережья. Конечно, нельзя исключить, что мы наблюдали лишь специфику данио-рерио, которая ничего нам не рассказала о людях и других животных. Я, однако, считаю это маловероятным, поскольку природа, как мы помним, бережлива, и базовые биологические механизмы встречаются во всем животном царстве. Любой кишечник проталкивает содержимое механическими сокращениями. Агрегация – в кишечнике и где угодно – одна из типичнейших моделей бактериального поведения. Потому-то крайне сложно представить, чтобы оба этих элемента динамики вдруг исчезали в вашем кишечном сообществе.

Несомненно, размеры кишечника, число видов в нем и параметры потока у личинки рыбы сильно отличаются от ваших. Как эти характеристики зависят от размера животного? Можно ли считать ваш желудочно-кишечный тракт увеличенным вариантом рыбьего или уменьшенным вариантом слоновьего? Мы пока не знаем. Несмотря на огромный интерес к микробиому человека и приличный массив работ по избранным животным моделям, кишечную экосистему других животных изучают без энтузиазма. Но эти неясности подводят нас к еще более широкому вопросу – масштабированию. Оказывается, существуют общие правила, по которым физические силы изменяются в зависимости от размера и формы, и результаты их действия кардинально различаются у организмов разных размеров. Как раз на эти правила мы и направим наше внимание.

Вы можете составить и собственный список, со своим диапазоном степеней числа 10. Как же меняются физические силы, действующие на животных и растения, когда мы поднимаемся и спускаемся по лестнице размеров? Рассмотрим для начала плавание.

Кит скользит по океану, плавно двигая хвостом вверх-вниз. Подобным же образом перемещаются акулы и многие другие рыбы: хотя из-за вертикальной ориентации плавников хвосты у них ходят из стороны в сторону, движение это остается возвратно-поступательным, то есть хвост попеременно движется в противоположных направлениях по одному и тому же пути. Если рассмотреть под микроскопом, как плывет бактерия, инфузория или другой микроорганизм, окажется, что все они перемещаются иначе, хотя и удивительным множеством способов: их жгутики вращаются подобно штопору, на клетке появляются выпячивания и так далее. Давайте разберемся, почему же их движения никогда не бывают возвратно-поступательными.

Любое существо, плывущее в воде, при продвижении выталкивает жидкость. Делать это тяжело по двум причинам. Первая – инерция: нужно приложить усилие, чтобы придать ускорение лежащему на земле мячу, и точно так же нужно приложить усилие, чтобы придать ускорение какой-то части ранее неподвижной воды (далее она будет стремиться продолжать движение с той же скоростью). Вторая причина – вязкость: когда мы ложкой толкаем мед, он тянет за собой и мед, который с ней не соприкасается, и нам необходимо приложить силу для преодоления такого сопротивления (оно обусловлено трением между слоями вязкой среды). Действие этих двух сил неизбежно. Отношение инерционной силы к силе вязкого трения назвали числом Рейнольдса – в честь пионера гидродинамики Осборна Рейнольдса, который в 1868 году стал вторым в истории Англии профессором инженерии². Каждая ситуация, в которой задействованы жидкости, характеризуется числом Рейнольдса, и это очень удобный, лаконичный способ описывать поток. Потоки с высоким числом Рейнольдса турбулентны: когда инерция доминирует над вязкостью, поток завихряется, и массы воды хаотически сталкиваются друг с другом, подобно мячикам. Потоки с низким числом Рейнольдса, напротив, спокойны: когда вязкость преобладает, поток постепенно затихает возле движущегося объекта. (Число это признают «высоким» или «низким» в сравнении с единицей, числом Рейнольдса, при котором силы инерции и вязкого трения равны.) Мы можем определить число Рейнольдса, зная свойства жидкости и движущегося в ней объекта. При высокой скорости, большом размере и низкой вязкости число Рейнольдса высокое, а при низкой скорости, малом размере и высокой вязкости – низкое.

Если бактерия размером 10^–6 метров движется в воде со скоростью около 10^–5 метров в секунду, соответствующее число Рейнольдса составит примерно 10^–5, или 0,00001, то есть будет совсем низким. Если же в воде плывет кит, число Рейнольдса будет около 10⁸, то есть очень высоким, в 10 000 000 000 000 раз выше, чем для бактерии. (Теперь вы понимаете, почему нам интересен лишь порядок величин: совершенно неважно, какова точная длина бактерии, 1 × 10^–6 или 2,61 × 10^–6 метров, поскольку числа Рейнольдса в любом случае различаются на 13 степеней числа 10.) Следовательно, бактерия и кит живут в очень разных жидких мирах: мир бактерии спокоен, а мир кита – турбулентен.

В знаменитой статье 1977 года «Жизнь при малом числе Рейнольдса» (Life at Low Reynolds Number) физик Эдвард Пёрселл объяснил, что этот факт на удивление сильно влияет на специфику движения водных существ. При высоких числах Рейнольдса потоки необратимы: если мы переместим объект по некоторому пути сквозь жидкость, а затем вернем его тем же путем обратно, в исходную точку, начальная конфигурация жидкости не восстановится. Иными словами, если вы нальете сливки в кофе, смешаете жидкости ложечкой, а затем вернете ложечку в исходную точку ровно по той же траектории, сливки не отделятся от кофе. Как крупные и быстрые животные, мы хорошо знакомы с миром высоких чисел Рейнольдса: такая необратимость настолько обыденна, что мы о ней даже не задумываемся. (У ложечки и кофе, кстати, число Рейнольдса близко к 10³: их движения приводят молекулы воды и компоненты сливок и кофе в состояние турбулентности.)

При низких числах Рейнольдса потоки обратимы. Если я возьму такую же чашку кофе и волшебным образом увеличу вязкость жидкости в миллион раз, сила вязкого трения выйдет на первый план, и состояние жидкости станет обратимым. Когда я проведу ложечкой в одну сторону, сливки вроде бы смешаются с кофе, но если я верну ложечку обратно по той же траектории, каждая частица жидкости тоже пройдет обратно по своей траектории, и сливки в итоге отделятся от кофе: мы увидим компактное сливочное пятно, неотличимое от исходного. Я очень люблю показывать на занятиях похожий фокус, когда во вращающемся цилиндре краситель смешивается с очень вязким кукурузным сиропом, а затем словно по волшебству отделяется от него. (Этот эффект в классическом учебном видео демонстрирует специалист по гидродинамике Джеффри Инграм Тейлор, ссылка есть в примечаниях³.)

Какое отношение это имеет к бактериям? Число Рейнольдса снижается как с повышением вязкости, так и с уменьшением скорости и размера. Как мы отметили, плавающая в воде бактерия живет в мире очень низких чисел Рейнольдса. Пёрселл понял, что в силу обратимости потока в их среде микроорганизмы просто не могут плавать с помощью возвратно-поступательных движений. Дело не в том, что у них не нашлось подходящих генов и не выработались необходимые биохимические реакции, а в том, что маленьким законы физики не позволяют так добраться куда бы то ни было. Если бактерия взмахнет какими-то своими жесткими отростками в одну сторону и продвинется вперед…

…она вернется назад на то же самое расстояние, когда приведет их в исходное положение:

Если траектории отростков не меняются, так будет происходить при любых скоростях возвратно-поступательных движений. Пёрселл назвал это теоремой о гребешке в честь моллюска, который движется, размыкая и смыкая створки своей раковины, – так, как никогда не смог бы, будь он микроорганизмом.

Как же тогда плавают микробы? Как угодно, но только не с помощью возвратно-поступательных движений. Одна из типичных тактик – вращение единственным или несколькими спиралевидными жгутиками.

Пока ротор не вращается в обратную сторону, жгутик не возвращается назад по пройденному пути и непрерывно толкает организм вперед. Некоторые микробы передвигаются, выгибаясь и извиваясь, но следят, чтобы их изгибы сразу же не повторялись. Еще один способ – махать поверхностными ресничками так, чтобы их обратный ход не был противоположен прямому. Реснички отводятся в одну сторону…

…а затем сгибаются при возвращении назад:

Конечно, вы далеки от микроскопических масштабов, но тоже постоянно пользуетесь таким движением: реснички выстилки вашей дыхательной системы продвигают и выталкивают наружу слизь, удерживающую микробы.

Таким образом, мир кита в корне отличается от мира бактерии. Чтобы преодолевать разделяющие их порядки величин, живым существам нужно не только уменьшаться или разрастаться, но и менять саму модель своего поведения.

Формы и масштабирование

Как мы увидели, разница в размерах может влиять на способ действий животных. То же самое относится и к формам, причем эти характеристики связаны. Чтобы составить представление о сложных формах животных, для начала рассмотрим простые, на первый взгляд, аспекты геометрии. Допустим, у нас есть квадрат, и мы вдвое увеличиваем длину каждой из его сторон. Площадь квадрата увеличивается в 4 раза, что видно на рисунке…

…или становится понятно, если призвать на помощь математику: площадь первого квадрата равна L × L = L², где L – длина стороны; площадь второго квадрата равна (2L)², или 4L². Если вдвое увеличить длину каждой из сторон равностороннего треугольника, его площадь тоже увеличится в 4 раза, а если увеличить каждую из сторон втрое, площадь возрастет в 3², то есть 3 × 3 = 9 раз[43].

Это верно и для треугольников с неравными сторонами при условии, что мы увеличиваем каждую из них в одинаковое число раз.

Во всех перечисленных случаях площадь пропорциональна квадрату длины. Иными словами, площадь поверхности масштабируется как L², что можно символически записать так: A ∝ L². При увеличении длины в 2 раза мы увеличиваем площадь в 2², то есть в 4 раза. Замена L на 3L даст нам увеличение площади в 3² = 9 раз, а на 4L – в 4 × 4 = 16 раз.

Вероятно, вам кажется, что в этом нет ничего сложного. В конце концов, скажете вы, мы изучаем площади простых фигур в начальной школе. Но этот разбор подспудно объясняет нам то, о чем упоминают не часто. Нам не нужно знать математические формулы для вычисления площади той или иной фигуры. Если увеличить вдвое размеры любой фигуры, не меняя при этом ее форму, площадь фигуры увеличится в 4 раза. Вся сущность площади сводится к тому, что это геометрическая характеристика, масштабируемая как L². Площадь круга, радиус которого увеличивается в 5 раз, возрастает в 5² = 25 раз, и нет нужды вспоминать соответствующую формулу. Площадь поверхности сферы, радиус которой увеличивается в 10 раз, возрастает в 100 раз. Площадь левого пятна на рисунке в 4 раза меньше площади правого, которое в поперечнике больше лишь вдвое:

Объем тела масштабируется как его длина в кубе, то есть L × L × L = L³. Чтобы убедиться в этом, можно нарисовать кубики (или другие тела, если вам хватит смелости) и показать, что удлинение каждой из сторон в 2 раза увеличивает объем в 2³ = 8 раз, удлинение их в 3 раза увеличивает объем в 3³ = 27 раз и так далее. И снова форма не имеет значения. Если увеличить радиус сферы в 4 раза, ее объем вырастет в 4³ = 4 × 4 × 4 = 64 раза. Если вдвое сократить длину трехмерной кляксы, сохранив ее форму, объем новой кляксы составит ⅛ от исходного.

Наконец, надо отметить, что при увеличении или уменьшении тела без изменения формы соотношение его размеров сохраняется. Если при пропорциональном увеличении треугольника его высота прирастает вдвое, то удваивается и основание. Все длины масштабируются так же, как L, что записывать вроде бы странновато, зато полезно держать в уме. Подобным образом все площади пропорциональны другим площадям: если мы увеличиваем тело так, что площадь его сечения возрастает в 4,7 раза, площадь его поверхности возрастает в те же 4,7 раза.

Универсальность всех этих правил масштабирования – их равное действие в отношении и длины, и площади, и объема – позволяет, как мы вскоре увидим, применять их к вопросам очертаний и размеров даже самых сложных органических форм. Но сначала ненадолго вернемся к бактериям. Из главы 9 мы узнали, что в вашем теле бактериальных клеток не меньше, чем человеческих, – и это слегка пугает, если думать лишь об их количестве, не учитывая занимаемое ими пространство. Диаметр типичной бактерии примерно в 10 раз меньше диаметра типичной человеческой клетки. Следовательно, ее объем меньше в 10³ = 1000 раз. Хотя микробов очень много, в сравнении с человеческими клетками их объем в вашем теле ничтожен.

Подобны ли формы больших и малых животных? Мы можем оценить это довольно точно, количественно, не ограничиваясь визуальным наблюдением. Как мы видели, если фигуры подобны, их объемы масштабируются как длина в кубе, а площади – как длина в квадрате. Верно и обратное: если объемы у какой-то выборки животных пропорциональны длине в кубе, а площади – длине в квадрате, то их формы в целом подобны. Выражаясь научным языком, они демонстрируют изометрическое масштабирование. Если объемы животных не пропорциональны, например, кубу высоты – скажем, если животные, увеличиваясь, становятся непропорционально коренастыми или если их размеры вообще не согласуются друг с другом при масштабировании, – мы понимаем, что природа отказалась здесь от изометрии и, видимо, руководствуется другими принципами. И сложнее всего как раз понять законы масштабирования реальных живых существ. Для этого можно, конечно, прибегнуть к уравнениям, но легче и разумнее использовать визуальный подход, а именно: нашу вторую математическую хитрость – инструмент под названием логарифмические графики.

Допустим, мы хотим построить график зависимости объема куба от длины его ребра. Обычно он выглядит так, как на рисунке слева, поднимаясь вверх по кубической параболе.

Если мы вместо этого нанесем такие же числа на другой тип миллиметровки, логарифмический, где на равном расстоянии друг от друга расположены деления, соответствующие степеням числа 10 (на рисунке справа), получится что-то интересное: точки окажутся на одной прямой. Более того, наклон прямой – число «вертикальных» степеней числа 10, поделенное на число «горизонтальных» (три степени на одну) – равен 3. Если построить график изменения площади поверхности, а не объема, у нас снова получилась бы прямая, но с наклоном 2. В общем случае, если y пропорционален x^p, где p – та или иная степень, то при построении графика зависимости y от x на логарифмической шкале получается прямая с наклоном p. Мы можем просто считывать степень масштабирования с графика. Эта способность визуально распознавать зависимости масштабирования по наклону линии на правильно составленном графике позволяет многое сказать о форме животных.

Таракан есть таракан есть таракан

Вооружившись графическими инструментами, мы можем вернуться к животным и задать животрепещущий вопрос: изометричны ли тараканы? Он, наверное, кажется глупым, но ответ может прояснить, какие механизмы влияют на формирование растущего животного, как механические стрессы действуют на разных представителей вида и даже как появляются новые виды. Вместо объема ученые часто оценивают массу животного, которую легко измерить обычным взвешиванием. Плотность клеток и тканей у большинства животных сходна, поэтому масса примерно пропорциональна объему. На графике я показал отношение массы тела к длине ноги нескольких разных тараканов, больших и маленьких⁴.

Данные не мои – как бы я ни любил природу, тараканов терпеть не могу, – а взяты из опубликованной в 1977 году статьи биолога Генри Пренджа, изучавшего механику экзоскелетов. Точки отменно выстраиваются по прямой. Разумеется, животные не столь идеальны, как кубы или сферы, поэтому показатели скорее разбросаны около линии, чем лежат прямо на ней. И все же наклон удачнее всего вписавшейся прямой равен 2,95, то есть почти 3, а это говорит нам, что масса масштабируется как длина в кубе – результат, ожидаемый для изометрических тел. (Я добавил на график горизонтальную и вертикальную линии с равномерно нанесенными засечками для наглядной демонстрации, что наклон равен 3.) Крупные тараканы – это лишь пропорционально увеличенные версии мелких: их размер меняется, но форма в целом сохраняется. Иными словами, тараканы изометричны.

Приведу еще один пример изометрии, на сей раз охватывающий разные виды животных. У всех млекопитающих есть легкие, через которые в их организм попадает свежий, богатый кислородом воздух. Вполне резонным был бы вопрос, как размер легких зависит от размера животного. Под «размером» можно подразумевать как площадь поверхности, так и объем. В следующей главе мы рассмотрим более интересную из двух величин – площадь поверхности, – а также ее глубинную связь с функцией легких и сбоями в их работе. Ну а пока разомнемся на показателе поскучнее – на объеме.

Можно было бы ожидать, что легкие млекопитающих изометричны, если, например, каждой клетке при каждом вдохе нужен одинаковый объем кислорода, а значит, общий объем кислорода пропорционален общему объему клеток в организме, то есть объем легких масштабируется в зависимости от объема животного. С другой стороны, можно предположить, что крупные животные нуждаются в непропорционально большом или малом объеме кислорода на клетку, а следовательно, объем их легких не будет пропорционален объему тела. В первом случае при построении зависимости одного объема от другого на логарифмическом графике наклон прямой равен единице, во втором – нет. Построим график на основе данных из статьи по физиологии легких, опубликованной в 1963 году⁵. Вместо объема животного снова возьмем его массу. У мышей, обезьян, ламантинов и других млекопитающих наклон прямой равняется единице (а точнее – 1,02); это свидетельствует об изометрическом масштабировании легких. Чем больше млекопитающее, тем пропорционально больше и объем его легких. Напрашивается вывод, что типичная клетка каждого животного насыщается примерно одинаковым объемом воздуха, как мы и предполагали. Но доступность кислорода может определяться не только объемом легких, и в двух следующих главах мы столкнемся с неизометрическим масштабированием, регулирующим перенос кислорода и обмен веществ.

Не стоит забывать, что логарифмические графики и степени масштабирования сами по себе не дают никаких объяснений – тем более верных. Они могут, однако, подтолкнуть нас к выводам, к которым трудно прийти иначе, – и это мы увидим на следующем примере.

Почему слоны не могут прыгать?

Как мы поняли, природа иногда подчиняется принципу изометрии. Но не всегда! Слон и прыгунчик[44] совершенно не похожи друг на друга, хотя и наделены длинными носами. Многие их мерки не проходят испытание на изометричность и подчиняются порой другим закономерностям. В качестве примера рассмотрим крупное семейство полорогих, охватывающее парнокопытных животных вроде огромного азиатского буйвола, среднеразмерных козы и овцы, а также всевозможных антилоп, включая 30-сантиметрового дикдика. В превосходной книге «О размерах и жизни»⁶ Томас Макмэхон и Джон Тайлер Боннер построили логарифмический график соотношения диаметра и длины плечевой кости многих полорогих (оба показателя, по сути, меры длины, а потому в случае неизменности формы должны быть пропорциональны друг другу). Я приведу его здесь. Если бы скелеты этих животных были изометричными, данные выстраивались бы лучше всего вдоль прямой с наклоном, равным единице, – я изобразил такую линию-ориентир пунктиром. Но в глаза бросаются совсем иные особенности графика.

Во-первых, зависимость между диаметром и длиной действительно есть: точки не рассыпаны по странице случайно. Во-вторых, эта зависимость не изометрична. Наклон линии наилучшего соответствия равен 1,5, что явно отличается от 1. Следовательно, полорогие отказались от изометрии, и толщина костей у крупных представителей семейства непропорционально больше, чем у мелких. Если мы удваиваем длину кости полорогого, диаметр нужно увеличить больше, чем вдвое, – в 2^1,5 раза, то есть примерно в 2,8 раза. Скелеты полорогих не подобны друг другу, их формообразование подчиняется какой-то другой закономерности.

Какова эта закономерность и откуда берется степень 1,5? Физическая подоплека здесь сводится к взаимодействию гравитации, которая тянет животных и все остальное вниз, и прочности костей, позволяющей животным стоять. Сила притяжения пропорциональна массе тела. Если масса возрастает в 10 раз, сила притяжения тоже возрастает в 10 раз. Прочность кости, в частности максимальная нагрузка, которую кость способна выдержать, зависит от площади ее поперечного сечения. Это не специфика костей, а общее для любой балки правило механики. Под действием таких законов наши полорогие столкнулись бы с ужасной проблемой, будь они изометричны. Например, если бы все длины в анатомии антилопы увеличились вдвое, но форма животного осталась бы прежней, объем антилопы вырос бы в 2³ = 8 раз. Масса животного, а следовательно, и действующая на него гравитация тоже увеличились бы в 8 раз. При этом площадь поперечного сечения костей изометричного животного, как и любая площадь, увеличилась бы только в 2² = 4 раза. Иными словами, прочность костей прирастает в меньшей степени, чем масса, которую должен поддерживать скелет. При таком раскладе возможны два варианта развития событий. В первом крупные животные отказываются от такой же, как у мелких, прочности костей (относительно их массы) и соответственно перестраивают свой образ жизни. Во втором они развивают непропорционально толстые кости, отказываясь от изометрического подобия в пользу костей, достаточно широких, чтобы их прочности хватало для компенсации гравитационного бремени. Полорогие пошли по второму пути.

Макмэхон, Боннер и другие ученые утверждают, что кости полорогих лишены подобия по форме, зато обладают эластическим подобием: их гибкость под действием гравитационных нагрузок у разных видов примерно одинакова. Оказалось, что тот самый показатель масштабирования 1,5 соответствует эластическому подобию: если кости избыточно утолщаются именно так, их сопротивление изгибу остается таким же, как у тонких костей, относительно действующей на них сгибающей силы. Иными словами, если мелкие полорогие могут ходить, бегать и пастись, то крупные способны делать то же самое благодаря архитектуре их скелета, которая масштабируется по принципу эластического подобия, а не изометрии. (Я существенно упрощаю картину и даже не поясняю, почему из всех разрушающих сил именно сгибающая служит определяющим фактором для скелетов.) Разумеется, полорогие не строили логарифмические графики и не производили механические расчеты. Просто эволюционным запросам больше всего удовлетворяли особи, кости которых подчинялись именно этой геометрической закономерности. Животные с более тонкими костями оказывались слишком слабыми, чтобы противостоять гравитации, а животные с еще более толстыми костями, со степенью масштабирования выше 1,5, вероятно, расходовали на формирование столь массивного скелета гораздо больше энергии, чем требовал образ жизни полорогих. Сами того не зная, эти копытные избрали задаваемый биологией и физикой путь, приведший их к изящному результату неизометрического масштабирования.

Я упомянул, однако, что в поисках баланса между прочностью костей и гравитацией крупные животные могут выбрать и другой вектор развития: отказаться от образа жизни, типичного для мелких животных. Как правило, они поступают именно так. Если построить логарифмические графики отношения диаметра к длине костей ног широкого спектра животных – кошек, собак, лошадей, слонов и так далее, – разброс точек будет соответствовать прямой с наклоном больше единицы (характерной для изометрии), но меньше 1,5. Кости слона поистине впечатляющи: мы со студентами восхищенно рассматривали бедро слона Туско, которое я притащил на занятия. Оно огромно: длиной в метр и с небольшую пальму в обхвате. (Туско, кстати, до старости влачил жалкое существование в цирках начала XX века, пока наконец не попал в куда более приятные условия зоопарка «Вудленд-парк» в Сиэтле. После смерти слона его скелет пожертвовали Орегонскому университету, где он служит студентам по сей день в качестве учебного пособия⁷.) Вместе с костью Туско я показал бедро койота, которое гораздо меньше – всего сантиметр в диаметре и 12 сантиметров длиной. Бедро слона в 9 раз длиннее и в 16 раз шире бедра койота. Кость Туско толще, чем потребовала бы изометрия (ее устроил бы диаметр в 9 раз больше), но все же тоньше, чем потребовало бы эластическое подобие (в 9^1,5, то есть в 27 раз больше). Нельзя винить слонов за отказ поддерживать эластическое подобие с животными помельче. Пойди они на это, кости составляли бы почти три четверти массы их тела и наверняка порождали бы кучу анатомических проблем⁸. Компромиссный выбор вылился в то, что относительно массы тела кости у крупных животных не так прочны, как у мелких. Потому-то койот может прыгать, а слон – нет: дополнительная нагрузка просто раздробила бы его кости. И именно по этой причине вольеры слонов в зоопарках часто окружают лишь узкими рвами, которые без труда перепрыгнули бы многие животные – но точно не слон.

О том, что у крупных животных кости непропорционально толстые, но все-таки не настолько, чтобы их относительная прочность соответствовала прочности костей мелких животных, известно довольно давно. Фактически о масштабировании костей писал еще Галилей в своем труде 1638 года «Беседы и математические доказательства, касающиеся двух новых отраслей науки…». Один из персонажей книги рассуждает: «Я думаю, что небольшая собака может нести на себе двух или даже трех таких же собак, в то время как лошадь едва ли может нести на спине одну только другую лошадь, равную ей по величине»[45]. Хотя Галилей и славился своими изобретательными экспериментами, сомнительно, что он ставил такой.

Осознавая, что размеры, формы и поведение животных взаимосвязаны, а характер этих связей часто определяется физическими силами, действующими в окружающей среде, мы сильно углубляем наши представления о природе. Например, эластическое подобие полорогих указывает нам на гораздо более глубокое единство между ними, чем можно было предполагать по их внешнему сходству. Возвратно-поступательные движения хвоста акулы свидетельствуют, что жидкость не сдерживает ее так сильно, как более мелких существ. Зависимости из категории масштабирования то и дело проявляются в живом мире с его гигантским диапазоном размеров, превращая концепцию масштабирования в одну из главных его тем. Масштабирование увязывает разнообразие форм и моделей поведения животных. И оно же помогает объяснить, откуда берется такое многообразие: организмы эволюционируют под действием физических сил, которые проявляются по-разному в разных размерных мирах. В следующей главе мы обратимся к масштабированию, связанному с поверхностями, и особое внимание уделим дыханию.

Далее возможны два варианта развития событий. Если деформация такова, что сила поверхностного натяжения компенсирует силу гравитации, насекомое не разрывает поверхностную пленку и остается над водой, поддерживаемое притяжением молекул воды друг к другу. Если же сила гравитации превышает максимальную силу поверхностного натяжения, поверхность разрывается и насекомое уходит под воду. К счастью для водомерок, эволюция повела их по первому пути. Поддерживающее свойство жидкости, кстати, легко продемонстрировать, аккуратно положив металлическую скрепку на поверхность воды. Если обе они очень чистые, жидкость будет поддерживать скрепку, несмотря на куда более высокую плотность последней. Если же протолкнуть скрепку чуть глубже, она утонет, поскольку поверхностное натяжение действует только на поверхности.

Итак, мы объяснили, почему водомерка бегает по воде, но пока не понимаем, почему те же аргументы не применимы к людям. Ведь даже если на вас действует гораздо большая сила гравитации, чем на водомерку, площадь соприкосновения тела с поверхностью воды в вашем случае тоже многократно больше. Разве не должна тогда увеличиться и противодействующая сила, направленная вверх? Должна, но ее величины все равно недостаточно, чтобы вы смогли стоять на водной глади бассейна. Причина опять же в масштабировании. Сила гравитации, как мы отметили в прошлой главе, пропорциональна массе тела, а следовательно, масштабируется вместе с объемом – как куб длины. Сила же поверхностного натяжения масштабируется не как куб или хотя бы квадрат длины, а просто как длина. Куб с ребром дюймовой длины, стоящий на воде, имеет 4-дюймовый периметр, ограничивающий зону контакта.

Куб с ребром в 2 дюйма имеет 8-дюймовый периметр, что лишь вдвое больше, чем у первого куба. Вдоль этого периметра поверхность воды изогнута и растянута относительно плоских зон, и потому именно пропорционально длине ребра масштабируется сила поверхностного натяжения. При прочих равных на одно животное, которое в 10 раз больше другого, действует увеличенная в 1000 раз сила притяжения, направленная вниз, а вот возникающая в жидкости сила, направленная вверх, оказывается больше лишь в 10 раз. Некрупное животное может удержаться на поверхности жидкости, но если мы представим, что оно растет, его тело очень быстро достигнет размера, при котором гравитационная сила окажется слишком велика, чтобы ей противостоять. Такой переход случается уже при размере в несколько миллиметров. Пока животное меньше, ему несложно держаться на воде за счет поверхностного натяжения, но как только оно пересекает этот рубеж, любые попытки обречены на провал.

Другим примером влияния поверхностного натяжения может служить поведение особой группы муравьев. Огненные муравьи – это несколько видов агрессивных муравьев, укусы которых особенно болезненны и сопровождаются жжением, собственно, и давшим им название. Эти насекомые живут в тропиках, где сильные ливни могут затапливать места их обитания, поэтому муравьям нередко приходится удерживаться на водной поверхности, сохраняясь при этом как колония³. Хотя насекомые и плотнее воды, один муравей невелик: как и водомерка, он может стоять на воде благодаря поверхностному натяжению. Но вот группа муравьев, в которой особи цепляются друг за друга, чтобы не потеряться, уже сталкивается с проблемой. Чем группа больше, тем сильнее разрыв между ее массой и поддерживающей силой поверхностного натяжения, которые масштабируются по описанным выше законам. Когда число муравьев превышает несколько десятков, гравитация перебарывает поверхностное натяжение и группа тонет. Ситуация лишь немногим улучшается, если вместо трехмерного клубка муравьи организуются в двухмерный плот: масса плоского плота увеличивается пропорционально квадрату длины, а поверхностное натяжение – пропорционально простой длине, поэтому баланс довольно быстро нарушается. Казалось бы, физика масштабирования ставит муравьев перед выбором рассредоточиться либо утонуть. Но эти насекомые нашли хитроумное решение – воздушные пузыри. Поверхность муравья гидрофобна, и он может прижимать пузырь к своему телу, как мать прижимает ребенка. Муравьиный плот прикрепляется к крупному воздушному пузырю, и плавучий пузырь не позволяет гравитации утянуть всех вниз. Поскольку поверхностное натяжение не в состоянии спасти муравьев, они делают ставку на низкую плотность воздуха и работают с другой частью уравнения – силой притяжения.

Но некоторые животные используют поверхностное натяжение напрямую. Одно из них – вы, и в следующем примере действие будет развиваться внутри вас – при каждом вашем вдохе.

Дыхание – тяжкий труд

7 августа 1963 года у президента США Джона Кеннеди и первой леди Жаклин Кеннеди на пять с половиной недель раньше срока родился сын Патрик Бувье. Два дня он боролся за жизнь, пытаяясь дышать, но не справился. Эта трагедия опечалила миллионы людей, но, хотя статус президентского сына и делал этого ребенка особенным, причина его смерти оказалась пугающе распространенной. Патрика убил респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН). Это главная причина смерти недоношенных младенцев, и связана она с проблемой поверхностей⁴.

При каждом вдохе вы тратите немало сил на наполнение легких воздухом. Легкие часто изображают как эластичные мешки, подобные воздушным шарикам и растягиваемые мышцами. Но ваши легкие не просто шарики, а влажные шарики. Клетки, выстилающие каждый из сотен миллионов крошечных альвеолярных мешочков, составляющих ваши легкие, покрывают себя тонким слоем жидкости (на рисунке это темный слой внутри альвеолы)⁵. При вдохе эластичная ткань растягивается, увеличивая площадь поверхности жидкости, то есть площадь ее взаимодействия с вдыхаемым воздухом. Однако жидкость, как всегда, «хочет», чтобы эта площадь оставалась минимальной, и потому противостоит ее увеличению.

И растяжение легочной ткани, и расширение ее жидкой пленки требуют усилий – и энергия на оба процесса тратится примерно одинаковая. Чтобы измерить это, можно накачать свежевскрытые легкие воздухом или водой. При наполнении водой не возникает интерфейса вода – воздух, а значит, и поверхностного натяжения, потому энергия расходуется исключительно на работу по растяжению ткани. При наполнении воздухом мы растягиваем ткань и увеличиваем площадь контакта воды и воздуха, на что уходит примерно вдвое больше энергии, чем при наполнении легких водой. Иными словами, около половины энергии, необходимой для дыхания, тратится на поверхностное натяжение. И это, в общем-то, неудивительно: как мы отмечали, площадь поверхности наших легких огромна.

Дыхание обходится нам дорого, но его цена возрасла бы еще, будь легочная выстилка покрыта чистой водой. Все жидкости натягиваются, но одни натягиваются сильнее, чем другие. У воды одно из самых сильных поверхностных натяжений среди распространенных жидкостей: оно примерно вдвое выше, чем у масел и спиртов, что связано с большой силой притяжения между ее молекулами. Мы можем снизить поверхностное натяжение воды, добавив в нее немного мыла. Чтобы продемонстрировать это, вернемся к скрепке, которую мы положили на поверхность воды несколько страниц назад: если добавить в воду хоть каплю жидкости для мытья посуды, скрепка утонет, поскольку сила натяжения мыльной поверхности не справится с ее весом. Этот эффект объясняется молекулярной структурой мыла. Мы помним из главы 5, что у каждой молекулы мыла, как и у липида, один конец гидрофобный, другой – гидрофильный. Следовательно, молекулы мыла охотно распределяются по поверхности воды гидрофобными хвостами в воздух. В результате поверхность перестает быть местом, которого молекулы воды стремятся избегать, и больше не требует высоких энергетических затрат. Соответственно, поверхностное натяжение сильно снижается.

В легких природа хитроумно снижает цену их расширения, тоже добавляя мыла. Выделения клеток легочной выстилки по-научному называются легочными сурфактантами[46], но термин «мыло» нагляднее описывает эти преимущественно липидные вещества. И снова мы сталкиваемся с примером самосборки: не получая никаких инструкций извне, выделяемые молекулы мыла выстраиваются на границе жидкости и воздуха и формируют слой, помогающий работать целому органу.

Критически важная способность снижать поверхностное натяжение в легких появляется у вас далеко не сразу после зачатия: легочные сурфактанты начинают вырабатываться на поздних стадиях эмбриогенеза. Когда недоношенные дети появляются на свет, у них – в зависимости от того, насколько раньше срока это случается, – сурфактантов либо мало, либо нет вовсе, и такие новорожденные дышат с трудом или совсем не могут дышать, поскольку их мышцам тяжело преодолевать поверхностное натяжение.

Патрик Кеннеди, конечно, не был единственным, кто в то время умер от респираторного дистресс-синдрома новорожденных. В одних только США в 1960-е РДСН уносил по 25 тысяч жизней в год. Но к 2005 году показатель ежегодной смертности от этого синдрома упал ниже 900. РДСН возникает, как и прежде, но теперь мы знаем, как с ним бороться: в легкие младенца нужно впрыскивать мыло. На самом деле это, разумеется, легочный сурфактант – либо полученный от животных, либо синтезированный в лаборатории, – но это не умаляет поразительной простоты и эффективности лечения, замешенного не на зубодробительной биохимии или генетике, а на физике дыхания. В основе этой простоты лежит самосборка: молекулы сурфактанта сами занимают нужные места в двухмерном интерфейсе воздух – жидкость. Ну а знания о поверхностном натяжении спасают жизни.

Поверхности и особенности их масштабирования определяют многие аспекты живой природы и служат отличным примером для объяснения, как масштабирование связывает микроскопическое (вроде структуры липидных молекул) с макроскопическим (например, с механикой расширения ваших легких). Масштабирование в очередной раз помогает нам разобраться в феноменах, которые мы наблюдаем внутри себя и прочих организмов. Масштабирование, однако, не панацея, и теперь мы рассмотрим пример, который до конца понять еще не можем.

Теперь представьте фигуру, образованную многократным ветвлением, когда одна прямая разделяется на две, затем каждая из них тоже раздваивается и так далее.

Даже после бессчетного количества ветвлений эта фигура будет выглядеть одинаково, в каком бы приближении мы ее ни рассматривали: она самоподобна.

Ветвление – один из множества способов создания самоподобия. Свойства сапомодобных объектов изучает неисчерпаемая область математики, называемая фрактальной геометрией. В частности, она рассматривает, как такие объекты формируются в ходе процессов вроде диффузии, как они заполняют доступное пространство, несмотря на дефицит вещества, и как нестандартно ведут себя в сравнении с одно-, двух– и трехмерными объектами, воспроизводя скорее поведение объектов с фрактальными параметрами (отсюда и название «фрактальная»). Фракталы помогают нам объяснить многие особенности мира природы. Ломкие прутики, растущие на тонкой ветке, выглядят примерно так же, как тонкие ветки, растущие на толстой, а те – как толстые ветки на стволе дерева: приблизительное самоподобие увязывает признаки в разных масштабах. Как отметил математик Бенуа Б. Мандельброт, «облака не являются сферами, горы – конусами, береговые линии нельзя изобразить с помощью окружностей»[48]. Иными словами, многие фигуры, встречающиеся в природе, в корне отличаются от простых, стандартных геометрических форм. Их самоподобие порождается не легкой модификацией сферической, конической или округлой форм, а представляет собой изначальную и неотъемлемую их суть. Мандельброт первым взялся за анализ таких форм и предложил термин «фрактал». (Шутят даже, что инициал Б. в его имени расшифровывается как «Бенуа Б. Мандельброт».) Хоть самоподобие реальных систем и не распространяется на бесконечно малые масштабы, фракталы служат бесценным пособием для изучения природы. Топология кровеносного русла у разных животных не воспроизводится в точности, но абстрактно любую кровеносную систему можно представить как ветвящийся, сетевидный фрактал (см. рисунок).

Уэст, Браун и Энквист представили загадку метаболического масштабирования как вопрос о фрактальных сетях из трубок⁸. Эти сети могут служить для поставки кислорода, крови, питательных веществ – чего угодно. Даже не пытаясь понять, какая интенсивность метаболизма необходима животному или растению, Уэст с коллегами задались вопросом о мощности потока, которую могла бы поддерживать подобная система снабжения. А это, конечно, вопрос физики и геометрии. Проталкивать жидкость по узкой трубке сложнее, чем по широкой. Если точнее, чтобы поддерживать ту же скорость потока в узкой трубке, площадь поперечного сечения которой вдвое меньше, чем широкой, давление в ней должно быть в четыре раза выше. Дальнейшее разветвление на более тонкие трубки, как в сети кровеносных сосудов, сопряжено с еще бо́льшими энергозатратами для организма, и их величина зависит от геометрии сети. Крупному животному нужно больше уровней ветвления, чтобы связать клеточный масштаб с масштабом целого организма. Уэст, Браун и Энквист выразили это математически и заметили, что самая эффективная фрактальная сеть масштабируется в такой зависимости от размера тела, что естественным образом всплывает степень масштабирования ¾ для зависимости интенсивности метаболизма от массы, то есть закон Клайбера.

Статья Уэста, Брауна и Энквиста, опубликованная в 1997 году в престижном журнале Science, наделала шума. С тех пор ее цитировали более чем в 4 тысячах научных работ. Казалось, что биофизика в основе закона Клайбера наконец прояснилась.

К несчастью, на этом история не закончилась. Чтобы определить геометрию энергетически оптимальной сети, нужно задействовать сложную математику, и несколько ученых заметили в доказательствах Уэста и коллег неочевидные, но значимые изъяны⁹. Проблема еще и в том, что модель фрактального снабжения основана на ряде допущений – связанных, например, с деталями архитектуры ветвления, – а они необязательно верны (для их проверки нам не хватает знаний). Эта модель не утратила привлекательности, но больше не может утверждать, что закон Клайбера вытекает из вполне понятных базовых принципов, и, вероятно, ставит его в один ряд с другими возможными законами природы, справедливость которых еще предстоит оценить.

Главная заслуга Уэста, Брауна и Энквиста, пожалуй, заключается в том, что своей концепцией они дали новый импульс изучению метаболизма и привлекли внимание многих биологов, физиков и математиков к этой теме. По ней впоследствии вышли тысячи статей, одни из которых искрили оптимизмом, другие критиковали фрактальные модели, в третьих их применяли к иным системам (подробнее я расскажу чуть позже), в четвертых концепцию развивали в неожиданных направлениях. Например, в 1999 году Джайант Банавар (ныне мой коллега по Орегонскому университету), Амос Маритан и Андреа Ринальдо разработали математическую модель, которая вообще не требует самоподобия¹⁰. Они изучали взаимоотношения между скоростью, с которой разветвленная сеть снабжения может доставлять материал, и объемом, занимаемым этой сетью, и пришли к выводу, что самой компактной будет сеть, в которой скорость доставки масштабируется как общий объем (или масса) животного в степени ¾. Это навело их на мысль, что животные эволюционировали в направлении минимизации объема их систем циркуляции, порождая тем самым закон Клайбера. Применение этой модели к метаболизму животных опять же требует нескольких допущений, в обоснованности которых часть ученых сомневается. И все-таки эти идеи любопытны.

Что же делать дальше? Как разгадать закон Клайбера и – в более широком смысле – постичь метаболизм? Как я уже упоминал, вполне возможно, что закон Клайбера – вовсе не закон, а показатель степени ¾ – самообман. Или же закон с подобным показателем может отражать те аспекты форм и очертаний, которые мы пока не понимаем. Но может быть и так, что закон Клайбера – это не фундаментальный метаболический принцип, а следствие других биофизических законов, которым подчиняется организм. Представьте, например, что животные состоят только из килограмма мышц и килограмма костей. Каждый из этих компонентов нуждается в характерном для него постоянном количестве энергетического ресурса, но при этом мышцы расходуют его быстрее, чем кости. Если бы пропорция мышц и костей сохранялась вне зависимости от размера животного, общая интенсивность его метаболизма была бы просто пропорциональна массе тела. Однако из главы 10 мы узнали, что у крупных животных кости толще. Доля костной массы в крупных телах больше, что помогает им компенсировать недостаточное повышение прочности костей относительно массы. Следовательно, общая интенсивность метаболизма животного должна была бы расти медленнее, чем масса в первой степени, выдавая нам показатель меньше единицы исключительно из-за механики костей, а не из-за чего-то, связанного с потреблением энергии или питательных веществ.

Разумеется, животные состоят не только из мышц и костей. Каждый орган и каждая ткань имеют специфические характеристики размера и формы, разные по степени изученности. В совокупности они могут определять метаболические характеристики организмов, описываемые простыми или сложными зависимостями. Такую точку зрения прекрасно выразил биохимик и писатель Ник Лэйн и точно сформулировал коллектив Питера Хочачки из канадского Университета Британской Колумбии¹¹. К сожалению, в исходной модели Хочачки и его коллег есть серьезные математические изъяны, поэтому нам только предстоит узнать, можно ли выковать из этого подхода стройную и убедительную теорию.

Кому нужно метаболическое масштабирование?

В этой главе мы пришли к выводу, что никаких выводов сделать не можем. Вам, дорогой читатель, возможно, непонятно, зачем я заставил вас продираться сквозь такие дебри, раз у этой истории пока нет удовлетворительного конца. А может, вы гадаете, почему кого-то вообще волнует головоломка со столь устойчивой репутацией крепкого орешка. Интерес к ней подогревается отчасти простотой вопроса – как интенсивность метаболизма зависит от массы? – и эмпирическими намеками на существование универсальных законов. Кроме того, ее разгадка внесет вклад не только в понимание животной энергетики.

Сколько леса нужно слону? Ответ частично определяется количеством листвы, которое он должен съедать для поддержания обмена веществ. Изменения в численности видов и доступном пространстве – например, из-за болезней, браконьерства или уничтожения лесов – могут различаться в пределах экосистемы в зависимости от метаболических нужд крупных и мелких животных. Можно задаться и более грандиозным вопросом: каков общий метаболизм экосистемы и существуют ли законы, которым подчиняются не отдельные ее представители? В этом ключе начали действовать Браун, Уэст и другие ученые, предложившие метаболическую теорию экологии¹². Есть надежда, что, разобравшись в метаболическом масштабировании, мы придумаем более действенные стратегии землепользования и охраны природы.

Метаболизм оказывает влияние на фундаментальные параметры нашей жизни, включая ее продолжительность. Наш слон, упомянутый в начале главы, живет гораздо дольше мыши. Средняя ожидаемая продолжительность жизни африканского слона превышает 60 лет. Мышь в среднем дотягивает до 2,5 лет, если только не становится чьим-то обедом раньше. Такая разница – пример общей тенденции: средняя продолжительность жизни в царстве животных повышается с увеличением массы тела. График отношения продолжительности жизни к массе млекопитающего демонстрирует масштабирование по степенному закону с показателем степени около ¼, но объяснения этому тоже нет. Поскольку показатель ¾ из закона Клайбера представляет собой целое число, кратное ¼, можно предположить, что у этих закономерностей одни истоки (как следовало и из моделей фрактальных сетей), хотя это может быть простым совпадением. Слон отличается от мыши и частотой сердцебиений: его сердце сокращается примерно 30 раз в минуту, а у мыши – около 600. И снова это иллюстрирует общую тенденцию, на сей раз к замедлению сердечных сокращений по мере увеличения размера, причем с показателем степени масштабирования –¼, тоже кратным ¼. (Отрицательная степень означает, что график в логарифмических координатах идет вниз.) Противоположные показатели степени для частоты сердцебиений и продолжительности жизни вместе ведут к любопытному следствию. При умножении частоты сердцебиений на продолжительность жизни, то есть количества сердечных сокращений в минуту на количество прожитых минут, мы получаем суммарное число сердечных сокращений за всю жизнь животного. Показатели +¼ и –¼ взаимно уничтожаются, и мы получаем число сердечных сокращений, которое не меняется в зависимости от массы (если точнее, перемножение массы в степени +¼ и массы в степени –¼ дает массу в нулевой степени, то есть прямую линию без малейшего наклона). Мышь, слон и остальные млекопитающие, хоть большие, хоть маленькие, переживают примерно по миллиарду сердечных сокращений. Люди, кстати, в этом отношении аномальны. Мы живем примерно вдвое дольше, чем «положено» животному нашей массы – как правило, 100-килограммовому млекопитающему природа отводит лет 30, – поэтому мы располагаем где-то 2 миллиардами сердечных сокращений. Эти зависимости между частотой сердцебиения, продолжительностью жизни, метаболизмом и другими параметрами могут быть случайными, а могут указывать на связи, способные проложить нам путь к постижению ряда фундаментальных аспектов жизни.

Удивительнее всего, пожалуй, то, что, поняв законы природного метаболического масштабирования, мы могли бы разобраться и в принципах неприродного масштабирования, определяющих, например, жизнедеятельность городов. Полагаясь на фрактальную модель, Джеффри Уэст и другие ученые утверждают, что города, как и живые организмы, управляются свойствами сетей¹³. Это могут быть переплетения шоссе, улиц и переулков; системы трубопроводов и электросетей, по которым текут жидкости или электроны; паутины финансовых трансакций; социальные сети, связывающие друг с другом людей. Результаты исследований позволяют предположить, что неожиданные законы масштабирования лежат в основе зависимостей уровня доходов, развитости дорожной сети, количества патентных заявок и многого другого от размера города. Впрочем, эти данные довольно неоднородны, и вытекающие из них тенденции еще более противоречивы, чем в случае с метаболизмом животных¹⁴. Тем не менее возможность открыть глубинные законы, руководящие жизнью городов, весьма заманчива – особенно потому, что продолжающаяся по всей планете урбанизация диктует необходимость в оптимизации городского проектирования и управления.

Какие бы интересные перспективы ни открывало понимание метаболического масштабирования, вас, возможно, по-прежнему угнетает, что в этой сфере мало что установлено однозначно. Ничего страшного – это расстраивает и меня. Главная проблема заключается в дисбалансе между обилием теорий и дефицитом данных. Статей о законе Клайбера больше, чем точек, по которым строится его график! Но наука не сводится к теоретизированию. По сути, науку делает наукой именно проверка идей на способность достоверно предсказывать реальный мир. Мы не испытываем недостатка в теориях, которые математически стройны, красивы – и ошибочны. Я руковожу исследовательской лабораторией, ориентированной на эксперименты, а не только на работу с уравнениями и программами, главным образом потому, что хочу наблюдать, как природа ведет себя на самом деле, и удивляться этому.

Концепции метаболического масштабирования сложно проверить опытным путем. Хоть мы здесь уже не раз представляли, как животные увеличиваются или уменьшаются в размерах, у настоящих слонов и мышей нет кнопок, позволяющих произвольно наращивать и снижать массу тела. Но у нас есть несколько хитроумных косвенных подходов. Например, Франк Юлихер, Йохен Ринк и их коллеги из Дрездена (Германия) недавно исследовали плоских червей, способных сильно – более чем в тысячу раз – увеличивать или уменьшать свою массу в зависимости от доступности пищи¹⁵. Примечательно, что зарегистрированная у них интенсивность обмена растет пропорционально массе тела в степени ¾, как и предсказывает закон Клайбера, и это не соответствует упомянутому выше показателю ⅔, характеризующему животных внутри вида. Ученые приписали эту форму масштабирования зависящим от массы изменениям в способах хранения жиров и сахаров внутри клеток червей. Нам только предстоит узнать, специфичен ли такой расклад для плоских червей или все животные приходят к закону Клайбера этим путем. Наша загадка остается загадочной. Чтобы разгадать ее, нам нужны новые данные, а может, новые животные.

Зависимости масштабирования, которые мы рассматривали в последних главах, отражают связи между клеточными механизмами, закодированными в геномах, и ограничениями действия физических законов на уровне больших масштабов. В третьей части книги мы увидим, как и зачем нам читать и переписывать геномы, перекраивая организмы так, чтобы это затрагивало их функции на разных масштабах. Можно предполагать, что изучение биофизических закономерностей масштабирования улучшает качество наших генетических предсказаний или что плоды генной инженерии позволяют нам лучше разбираться в законах масштабирования. Оба варианта могут быть справедливы.

Предсказуемая случайность броуновского движения – важнейшее условие для такого способа перемещения. Без нее ДНК застревала бы в геле, каким бы сильным ни было электрическое поле: попади концы нити в разные поры, молекула повисла бы на препятствии, как полотенце на веревке, и не смогла бы высвободиться. Но благодаря броуновскому движению ДНК постоянно колеблется и переориентируется, выбираясь из одного отверстия и проскальзывая сквозь другое. Статистическая прогнозируемость микроскопической случайности дает нам четко определенную и поддающуюся математической обработке скорость движения молекулы.

Итак, после амплификации ДНК с проставлением концевых меток и прогона фрагментов ДНК через гель под действием электрического поля[51] мы получаем возможность прочитать нуклеотидную последовательность. Все фрагменты одной и той же длины будут светиться одним цветом. Допустим, нити из 27 нуклеотидов заканчиваются модифицированным Ц, несущим, скажем, красную метку. А нити из 28 нуклеотидов заканчиваются модифицированным T с синей меткой. И так далее. Среди нитей из 27 нуклеотидов нет ни одной синей, поскольку все фрагменты этой длины, как точные копии друг друга, должны заканчиваться Ц, а все терминирующие Ц – красные. (Быть может, читая последние страницы, вы переживали за выпавшую из нашего поля зрения вторую исходную цепь ДНК, которая могла бы стать матрицей для второго набора молекулярных фрагментов. Не бойтесь: в секвенировании по Сэнгеру особый подбор праймеров заставляет ДНК-полимеразу работать только с одной из цепей двойной спирали, потому вторая вообще не реплицируется.)

Все фрагменты ДНК совместно попадают в тонкую трубку с гелем, проходя по которой, разделяются из-за разной скорости движения. Наблюдая за флуоресценцией проходящих через трубку точек, ученый фиксирует, например, вначале красный сигнал, затем синий, еще один синий, за ним зеленый и так далее, и интерпретирует их как последовательность ЦTTA+++++. Вот мы и прочитали ДНК.

Секвенирование по Сэнгеру и его вариации, которые совершенствовались по мере развития технологий, сегодня часто называют методами секвенирования первого поколения. В середине 1980-х они позволяли читать ежедневно около тысячи нуклеотидов, или, как принято говорить, оснований. Разницей между нуклеотидами и основаниями здесь можно пренебречь. (Но если быть точными, нуклеотид состоит из аденинового, цитозинового, гуанинового или тиминового азотистого основания, сахара под названием дезоксирибоза и нескольких атомов фосфора и кислорода, объединенных в фосфатную группу. Сахара соседних нуклеотидов связываются друг с другом через фосфатные группы, формируя нить ДНК.)

Чтобы установить последовательность всего генома, нужно виртуально соединить друг с другом все фрагменты. В 1982 году мы собрали полный геном бактериального вируса из 40 тысяч оснований, малый фрагмент которого в 1968 году прочитали Ву и Гилберт. Геном дрожжей S. cerevisiae (12 миллионов оснований) полностью секвенировали в 1996-м, а геном круглого червя C. elegans (100 миллионов оснований) – в 1998-м. Но самой желанной целью был, конечно же, геном Homo sapiens. Секвенирование по Сэнгеру в принципе могло бы справиться с этой задачей, но применение этого метода в отношении генома с миллиардами оснований представлялось огромным технологическим вызовом. Такая задача требовала усовершенствований не только в биохимии – связанных, например, с терминирующими нуклеотидами, – но и в инструментарии физической работы с ДНК: нужно было повышать скорость и надежность плавления и перемещения молекул, детекции световых сигналов и многого другого.

В 1988 году Конгресс США одобрил выделение средств на проект «Геном человека», который планировали запустить в 1990-м и потратить на его реализацию 15 лет и 3 миллиарда долларов. (Для сравнения: в 1990 году совокупные расходы федерального бюджета США на исследования вне оборонного сектора составили около 23 миллиардов.) Подобно космической программе «Аполлон» в 1960-х, проект «Геном человека» ассоциировался с покорением новых рубежей – на сей раз во внутренней вселенной клетки. Государство осуществляло финансирование и управление проектом через Национальные институты здоровья и Министерство энергетики США, хотя и при значительном участии партнеров из других стран. В 1998 году финансируемая из частного капитала группа биотехнолога Крейга Вентера объявила, что планирует самостоятельно секвенировать геном человека, причем быстрее и дешевле. Это положило начало яростной гонке. Обе группы добились успеха и в 2001 году сообщили о прочтении 90 % генома человека. В 2003-м доля покрытия выросла до 99 %, что позволило заявить о выполнении задачи, по сути, на два года раньше намеченного срока. Но нужно было дочитать еще несколько фрагментов, которые не удалось секвенировать сразу из-за сложностей типа длинных нуклеотидных повторов, и к 2004 году геном был определен уже на 99,7 %³.

Вам, возможно, интересно, чей геном тогда секвенировали. В обоих проектах геномы были коллективными: ДНК брали у нескольких человек, и разные прочитанные фрагменты от разных людей должны были дать общую для нашего вида картину. В итоге, однако, вышло так, что бо́льшая часть генетического материала принадлежала двум персонам: в проекте «Геном человека» – вроде бы анониму из города Буффало в штате Нью-Йорк, а в проекте Вентера – анониму, которым, как выяснилось позже, был… сам Крейг Вентер. Эти люди, разумеется, не представляют все человечество: чтобы изучить целый вид, нам нужно добыть его статистический портрет, то есть секвенировать гораздо больше человеческих геномов. Точно так же, если бы у меня обнаружили рак, мой врач захотел бы взглянуть на геном моих, а не средневидовых, злокачественных клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения, требовались гораздо более быстрые и дешевые технологии. К счастью, их внедрение было уже не за горами.

При общей стоимости 3 миллиарда долларов чтение каждой пары оснований в проекте «Геном человека» обходилось примерно в доллар. Это было поразительным достижением с учетом того, что еще не сменилось даже поколение, не знавшее структуру ДНК, но все же недостаточным, чтобы применять такую технологию рутинно. В начале XXI века появилось несколько новых хитроумных методов, разработанных отчасти благодаря госфинансированию инноваций в сфере секвенирования. В совокупности эти методы второго поколения называют еще высокопроизводительными, но чаще просто секвенированием нового поколения⁴. В секвенировании первого поколения (по Сэнгеру) намноженные фрагменты читаются по очереди. Их смешивание обернулось бы катастрофой, поскольку мы потеряли бы уникальное соответствие между длиной оборванного субфрагмента и его меченым нуклеотидом-терминатором. В методы второго поколения изначально заложена параллельность: они позволяют анализировать множество фрагментов одновременно, а в ряде случаев даже читать цепи ДНК по мере их синтеза. Давайте познакомимся с несколькими новыми методами. Различаясь массой деталей, все они используют физические свойства ДНК и (или) связанных с ДНК материалов.

Пиросеквенирование появилось отчасти благодаря удивительным способностям светлячков⁵. Как мы знаем, ДНК-полимераза прикрепляет новые нуклеотиды к растущим нитям ДНК. Тщательно пересчитав атомы в составе свободного нуклеотида и в составе встроенного в нить, мы обнаружим, что соответствие между ними не полное. В ходе реакции пришивания нуклеотида к цепочке ДНК высвобождается крошечная молекула из двух атомов фосфора и семи атомов кислорода – пирофосфат. Особый белок в составе смеси для пиросеквенирования превращает пирофосфат в АТФ – энергетическую молекулу, которую клетки используют для разных операций. Одна из них – светоиспускающая химическая реакция, выполняемая белками люциферазами, которые расходуют АТФ в качестве топлива. (В переводе с латыни lucifer означает «несущий свет».) Такие организмы, как светлячки, жуки-щелкуны и светящиеся грибы, сами производят люциферазы. Как мы узнали, рассматривая в главе 2 зеленый флуоресцентный белок медузы, многообразие жизни предоставляет нам уйму инструментов, которые можно творчески приспособить для множества задач.

Пиросеквенирование работает следующим образом. Как и в методе Сэнгера, все начинается с множественного копирования фрагментов ДНК и их разделения на одиночные цепи нагреванием. И снова ДНК-полимераза строит вторую, комплементарную цепь по матрице одиночной. Представьте, что у нас в реакционной лунке закреплена единственная одноцепочечная молекула ДНК. Ученый наливает в эту лунку раствор, содержащий люциферазу и другие ингредиенты, но из четырех типов нуклеотидов там есть только один – скажем, А. Если за этим следует световой импульс, значит, ДНК-полимераза встроила А в растущую цепь, то есть он оказался подходящим, комплементарным первому неспаренному нуклеотиду матрицы. Если вспышки нет, А не подошел и нужно пробовать другие нуклеотиды. Ученый выливает из лунки раствор с A и трижды повторяет процесс – с Ц, Г и T. Лишь в одном случае из четырех он видит вспышку света. Теперь очередная буква известна. Повторяя процесс снова, он по излучению кванта света узнает следующую букву, затем еще одну и так далее. То есть ДНК читается по мере синтеза ее комплемента.

Я не объяснил, как можно распараллелить процесс. Помимо этой задачи у метода крайне высоки требования к чувствительности: высвобождение единственного пирофосфата должно неизбежно вести к тому, чтобы единственная люцифераза испустила одиночный, очень слабый световой импульс, который мы во что бы то ни стало обязаны засечь. Если на любом из этапов произойдет сбой, мы пропустим букву. Обе задачи, параллелизм и надежность, решаются с помощью одной физической тактики – объединения идентичных фрагментов ДНК в массивы.

Как и в секвенировании по Сэнгеру, геномную ДНК дробят на случайные фрагменты длиной до тысячи оснований, к их концам пришивают короткие универсальные адаптеры с известными нуклеотидными последовательностями. Затем плавлением разделяют все фрагменты на отдельные цепи (см. главу 1) и смешивают в растворе с микроскопическими шариками, к поверхности которых привязаны маленькие «якоря», комплементарные одному из ДНК-адаптеров. Пропорции смеси продумывают так, чтобы шариков оказалось значительно больше, чем ДНК, и вероятность заякоривания на каждом шарике сразу нескольких фрагментов ДНК стремилась к нулю.

Шарики и ДНК плавают в водном растворе. Если смешать его с маслом, при взбалтывании или в потоке образуются окруженные маслом капли раствора, заключающие в себе не более одного шарика и размером не сильно его превосходящие.

Те самые «якоря» на поверхности шариков служат праймерами для инициации синтеза цепи ДНК, комплементарной взаимодействующему с якорем фрагменту. В каждой капле раствора содержится все необходимое для ПЦР[52]: ДНК-полимераза, нуклеотиды и праймеры для последующих раундов репликации. Так в капле можно создать около миллиона копий исходного фрагмента. По окончании репликации капли собирают вместе и добавляют к ним мыло или спирт, чтобы уменьшить силу поверхностного натяжения, благодаря которой каждая капля в масле оставалась изолированной (см. главу 11). Капли сливаются, и раствор течет по плашке с крошечными лунками диаметром чуть больше шарика. В результате в каждую лунку попадает по одной сфере, покрытой множеством одинаковых двуцепочечных ДНК; одна из цепей каждого дуплекса удерживается на шарике якорными праймерами. Когда мы плавим эту ДНК и смываем высвобожденные нити, у нас остается множество распределенных по лункам сфер, каждая из которых покрыта своим типом леса из идентичных однонитевых ДНК.

Теперь можно приступать к пиросеквенированию и фиксировать в каждой лунке вспышки света. Они возникают то и дело по мере синтеза цепей ДНК, комплементарных миллиону связанных с шариком матриц. Соответственно, вспышки эти в миллион раз ярче, чем при испускании света одной молекулой ДНК. Если в последовательности ДНК несколько раз подряд повторяется одна и та же буква, яркость вспышки растет пропорционально числу повторов (до некоторого предела): двойная А, например, дает вспышку вдвое ярче. Ученые, а точнее их аппараты, фиксируют последовательность и интенсивность световых сигналов и таким образом читают ДНК.

Эта сложная схема действительно работает и благодаря приемлемой надежности стала первым коммерциализированным методом секвенирования нового поколения: в 2005 году его вывела на рынок компания 454 Life Sciences. Примерно за 500 тысяч долларов можно было купить прибор для пиросеквенирования, выдающий в виде длинной череды букв нуклеотидную последовательность загруженной в него ДНК⁶. При такой стоимости вы вряд ли украсили бы им свою гостиную, но исследовательским институтам среднего размера он был вполне по карману. (Для сравнения: в 2005 году дом в США можно было купить в среднем за 240 тысяч долларов.) Сегодня пиросеквенаторы не продаются: их уже успели вытеснить новые, не менее впечатляющие технологии.

В близком к пиросеквенированию методе – полупроводниковом секвенировании – ставка делается на другой элемент, высвобождаемый при встраивании нуклеотида в растущую нить ДНК⁷. Он настолько мал и вроде бы незначителен, что опора на его детекцию кажется совсем уж удивительной. Это одиночный протон. Все, что окружает нас, состоит из протонов, нейтронов и электронов. Легчайший из химических элементов, водород, представляет собой совокупность одного положительно заряженного протона и одного отрицательно заряженного электрона. Одинокий протон и того меньше. Обнаруживать его быстро и надежно позволяет совершенно не биологическая технология – транзистор.

Транзисторы – основные компоненты электрических схем мобильных телефонов, компьютеров и несметного числа других электронных устройств. В каждом транзисторе электрический ток течет от одной точки к другой, ориентируясь на указания, поступающие из третьей точки, примерно как движение речных судов подчиняется командам оператора разводного моста. В так называемых полевых транзисторах контролирующим фактором выступает электрическое поле – например, поле протона, находящегося вблизи поверхности транзистора.

Как и при пиросеквенировании, шарики, покрытые фрагментами клонированной ДНК, распределяются по отдельным микролункам. Но эти лунки размещены на полупроводниковом чипе, где у дна каждой из них работает особый полевой транзистор. Вместо вспышек света здесь регистрируются импульсы электрического тока[53]. Эту технологию коммерциализировала компания Ion Torrent, основанная весьма продуктивным биотехнологом Джонатаном Ротбергом, который раньше возглавлял 454 Life Sciences. Ion Torrent представила свой секвенатор Personal Genome Machine в 2010 году⁸. Он умещался на столе и стоил всего 50 тысяч долларов – меньше удвоенной средней стоимости нового автомобиля в том же году.

Однако господствующая технология секвенирования нового поколения полагается на искусную химическую модификацию ДНК, а не на замысловатую детекцию встраивания нуклеотидов⁹. Как вы помните, в секвенировании по Сэнгеру рост новой цепи ДНК прерывается присоединением модифицированного нуклеотида. К концу 1990-х созрело более гибкое решение – обратимо терминирующие и флуоресцирующие нуклеотиды. Во время репликации, то есть синтеза комплементарной цепи, изучаемого ДНК-фрагмента ученый вводит модифицированные A, Ц, Г или T, каждый из которых флуоресцирует уникальным цветом и обрывает дальнейшее наращивание цепи[54]. После отмывки образца от не встроившихся молекул ученый с помощью лазера регистрирует цвет только что добавленного в цепь нуклеотида. Флуоресцирующий участок и участок, блокирущий работу полимеразы, крепятся к нормальному «телу» нуклеотида цепочкой из атомов, которую можно химически расщеплять. После обработки расщепляющими агентами ученый получает обычную, без терминаторов и меток ДНК, готовую к присоединению следующего нуклеотида, и так процесс раз за разом повторяется. Как правило, реакции проводят на стеклянных плашках, усеянных кластерами реплицирующихся фрагментов ДНК, а камеры фиксируют цветовые вспышки, которые появляются и исчезают в каждом кластере.

Эта технология известна как метод Illumina – по названию компании, которая приобрела ее разработчика. Инструментарий для такого секвенирования стоит где-то от 100 тысяч до миллионов долларов в зависимости, например, от количества оснований, определяемых за одно прочтение. Как и в других технологиях секвенирования, нужно немало времени и денег, чтобы подготовить образцы ДНК, стеклянные плашки с образцами или другие платформы. Без учета расходов на покупку секвенатора прочитать миллиард ДНК-оснований методом Illumina стоит от 5 до 150 долларов, а методом полупроводникового секвенирования – около 10 тысяч долларов, и это существенно повышает привлекательность первого метода. Ниже я еще вернусь к вопросу стоимости, но хочу отметить, что все эти суммы в любом случае гораздо меньше тех 3 миллиардов долларов, которые ушли на секвенирование 3 миллиардов оснований в исходном проекте «Геном человека».

Читаем слова по одному

Провести черту между вторым и третьим поколениями методов секвенирования сложнее, чем между первым и вторым. Новые техники появляются не взрывоподобно, перемежаясь затишьями, а рождаются в результате непрерывной деятельности на множестве пересекающихся фронтов. Но все же есть удобный и относительно корректный с хронологической точки зрения способ выделить третье поколение: эти методы предполагают секвенирование одиночных молекул ДНК без их амплификации.

Так, в рамках одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT), выведенного на рынок компанией Pacific Biosciences, отдельные молекулы нетипичной ДНК-полимеразы фиксируют в наноячейках на кремниевой подложке с алюминиевым напылением и, прицельно освещая через дно, наблюдают за их работой¹⁰. Подложка обладает такими оптическими характеристиками, что флуоресцирующие разными цветами нуклеотиды видны только в момент их встраивания в растущую молекулу ДНК[55].

В самой интересной из новых технологий секвенирования ДНК, нанопоровой, не используют ни растущую ДНК, ни цветные нуклеотиды, ни даже ДНК-полимеразу¹¹. Здесь можно пренебречь всем, что на последних страницах было написано о методах, в которых секвенирование привязано к синтезу, и вернуться к тому, с чего мы начинали: поочередно определять нуклеотиды на уже сформированной нити ДНК. Как мы помним, различать основания с помощью света невозможно, зато можно рассчитывать на электричество.

Представьте единственную пору нанометрового масштаба в мембране, разделяющей резервуар с жидкостью на два отсека. В водном растворе по обе стороны от нее содержатся ионы – электрически заряженные атомы или молекулы. При приложении к резервуару напряжения ионы начинают проходить сквозь пору, и силу этого электрического тока можно измерить. Если пора частично перекрыта, ток будет слабее – иными словами, сила тока показывает, насколько пора доступна ионам. Теперь представьте, что через пору протискивается нить ДНК. Ее основания – A, Ц, Г и T – различаются числом атомов и размерами, а следовательно, попадая в пору, по-разному снижают силу тока. Чтобы превратить этот принцип в метод секвенирования, нужно уметь оптимально протаскивать ДНК сквозь пору. В первых устройствах отрицательно заряженная по своей природе ДНК перемещалась, как и прочие ионы, под действием разности потенциалов на сторонах мембраны. Но работало это плохо – в основном потому, что молекула проскальзывала через пору слишком быстро и точно измерить силу тока при прохождении каждого нуклеотида не получалось. Как же решили эту проблему? Один из подходов задействовал белки. Существует немало белков, которые в норме передвигаются вдоль ДНК и совершают с ней какие-то действия, – например, ДНК-полимеразы или хеликазы. Если зафиксировать один из таких белков у входа в нанопору (на следующем рисунке изображен как светло-серые спирали¹²), он будет своим обычным рабочим инструментарием размеренно направлять ДНК в пору. Из главы 2 мы узнали, что многие белки можно считать природными машинами нанометровых масштабов. Здесь одну из них нагрузили работой в месте, недоступном для других исполнителей. Кроме того, белки способны формировать и сами поры: как мы выяснили в главе 2, многие пронизывающие мембрану белки могут укладываться так, что внутри них образуется сквозной канал. И вот мы снова наблюдаем самосборку.

Концепция нанопорового секвенирования проста, и еще в 1980-х в ней читались задатки перспективной технологии. Ее реализация, однако, потребовала немалых усилий. Сначала ученые показали надежность внедрения нанопор в искусственные барьеры – тогда еще не с целью секвенирования, а просто для понимания структуры пор и разработки платформ, позволяющих работать с мембранно-белковыми комплексами. Первые опыты по переносу ДНК через поры с помощью электрического поля помогли разобраться в физике движения в ограниченных пространствах. Хотя к началу 2000-х специалисты уже располагали основными принципами, многим сторонним наблюдателям, включая меня, было сложно разглядеть в нанопоровом секвенировании мощную и надежную технологию будущего. Необходимо было искусно скомпоновать поры, ДНК-связывающие белки, мембраны в несколько нанометров толщиной и электроды. Затем нужно было отработать высокочувствительные измерения силы тока и исключить при этом закупорку пор примесями или поврежденными белками. Эту пугающую инженерную задачу взвалила на себя компания Oxford Nanopore, которая занимается, как можно догадаться, в основном нанопоровой детекцией молекул. Первый прибор ученым представили в 2014 году – это была пилотная версия для оценки эффективности метода, – а теперь на рынке мы можем выбирать уже из нескольких разных аппаратов. Самый маленький сравним по размеру с большим пальцем или флешкой и, прямо как она, подключается к компьютеру через USB-порт. Привлекательность прибора во многом объясняется портативностью и низкой стоимостью. Например, в 2014-м с его помощью секвенировали геном эболавирусов, выделенных из 14 гвинейских пациентов. Его картировали уже через два дня после взятия проб, блестяще продемонстрировав потенциал скоростного секвенирования в полевых условиях. Эта технология позволяет оперативно выявлять источник распространения болезни и потенциально опасные варианты патогенов.

Недостаток нанопорового секвенирования в его не самой высокой точности: несколько процентов оснований может читаться некорректно, при том что метод Illumina допускает лишь около 0,1 % ошибок. Величина погрешности, правда, важна не всегда. При составлении подробной карты генома и в пренатальных анализах на точечные, но значимые мутации нам критически важно сводить число ошибок к минимуму. В мониторинге потенциально опасных патогенов и состава микробных сообществ сниженная точность метода вполне компенсируется его быстротой и удобством[56].

Геном дешевеет и дешевеет

Прорывы в секвенировании ДНК оказались поразительными, и от будущего, вероятно, следует ожидать еще большего. Я уже упоминал рыночную стоимость этих технологий, а теперь давайте посмотрим, во что ученым обходится определение нуклеотидной последовательности образца ДНК. Удобной мерой будет стоимость секвенирования одного человеческого генома – иными словами, 3 миллиардов оснований. Как вы помните, на первый геном ушло 3 миллиарда долларов США, по доллару на основание. Уже к 2006 году затраты снизились больше чем на 99 % – примерно до 13 миллионов долларов. График изменения стоимости секвенирования во времени просто изумляет.

Стоимость секвенирования одного человеческого генома

Вертикальная ось на этом графике логарифмическая, горизонтальная – обычная. Стоимость секвенирования снижается быстро и непрерывно¹³. Обвал 2007–2008 годов – удешевление в тысячу раз за полдесятилетия – знаменует переход к методам секвенирования нового поколения. Вместе со стоимостью стремительно сокращается продолжительность секвенирования одного генома – с нескольких лет в проекте «Геном человека» до нескольких дней при использовании современных техник.

С похожей скоростью, пожалуй, развивались технологии производства транзисторов. Первые транзисторы были капризными и громоздкими, миллиметрового масштаба. Теперь мы без труда помещаем миллиарды транзисторов на чипы площадью в квадратный сантиметр и стоимостью несколько долларов за штуку. В 1965 году Гордон Мур, впоследствии возглавивший компанию Intel, заметил, что количество транзисторов на чипе удваивается каждый год (позже он скорректировал оценку с года на два). Это наблюдение вошло в историю под названием «закон Мура» и служило одновременно описанием и манифестом электронных технологий. Прогресс в секвенировании ДНК, по крайней мере измеряемый затратами на чтение одного нуклеотида, был даже более стремительным. Неудивительно, что первым человеком, геном которого секвенировали с помощью Personal Genome Machine компании Ion Torrent, стал именно Гордон Мур. Революцию в технологиях секвенирования породило множество факторов: человеческая изобретательность, экономические стимулы компаний-производителей, государственное финансирование теоретических исследований и спецпрограмм, нацеленных на инновации в области секвенирования¹⁴, ну и, конечно, накопленные нами знания по биологии, химии и физике.

Когда секвенатор ДНК не соответствует своему названию?

Последовательности ДНК сообщают нам немало информации: например, как на генетическом уровне различаются виды, особи одного вида, раковые и нормальные клетки. Тем не менее главной миссией технологий секвенирования может оказаться вовсе не чтение генов и геномов, а помощь в постижении внутренней жизни клеток.

Рассмотрим для примера РНК. В первой части книги мы говорили, что чтение генов обеспечивает фермент РНК-полимераза: она транскрибирует последовательность ДНК в последовательность РНК, которая затем может транслироваться в цепочку из аминокислот – белок. Не считая яйцеклеток, сперматозоидов и некоторых иммуноцитов, все клетки вашего организма имеют одинаковый геном, поэтому секвенировать ДНК каждой клетки было бы избыточным. Зато интересно было бы знать, какие молекулы РНК синтезируются в каждой клетке: так мы могли бы понять, какие гены включаются и выключаются, когда клетки в ходе развития становятся кровяными тельцами или нейронами либо когда реагируют на изменения в питании или на стресс. Для этого нам необходимо секвенировать молекулы РНК, четко зная, из какой клетки они получены. Вы уже, наверное, представляете характерные черты нашей методологии: мы используем физические силы и свойства, дополняя их биологическими инструментами, разработанными природой.

На этот раз вместо медуз и светлячков нашими помощниками станут вирусы. Центральная догма молекулярной биологии гласит, что ДНК кодирует РНК, которая кодирует белки. Когда в 1970-м исследовательские группы Дэвида Балтимора и Говарда Темина независимо друг от друга открыли способность некоторых вирусов обращать этот процесс вспять – транскрибировать свой РНК-геном в ДНК, которая еще и внедряется в геном клетки-хозяина, – эта новость многих потрясла. Вирусный белок, производящий, по сути, обратную транскрипцию, назвали соответственно – обратной транскриптазой (ревертазой)¹⁵. Теперь мы умеем использовать ее в своих целях, как обычную ДНК-полимеразу и другие подобные инструменты.

Выделив РНК из клетки, мы можем добавить к ней обратную транскриптазу и свободные нуклеотиды, чтобы синтезировать ДНК, комплементарные однонитевым РНК. Например, в случае РНК-последовательности ЦAГУУГГA мы получим ДНК-комплемент ГTЦAAЦЦT (как вы помните из главы 3, У в РНК заменяет T в ДНК). С помощью секвенирования мы узнаем точную нуклеотидную последовательность этой комплементарной ДНК (кДНК), а значит, и исходной РНК. Чтобы изучить полный набор РНК (транскрипто́м) отдельной клетки, ученые применяют методы вроде тех, что мы уже рассматривали: например, изолируют одиночные клетки с шариками и необходимыми ингредиентами в каплях водно-масляной эмульсии¹⁶. Каждая молекула РНК транскрибируется в ДНК, которая затем секвенируется – и вот мы уже знаем, какие гены были «включены» в той или иной клетке.

Хотя секвенирование транскриптома одиночных клеток и предполагает их разрушение, они служат типичными представителями той или иной клеточной популяции, траекторию развития которой можно проследить, отбирая из нее такие вот жертвенные единицы на разных этапах какого-то процесса либо после специфического воздействия. Так ученые исследовали, например, ответные изменения экспрессии генов у иммуноцитов организмов, вступивших либо не вступивших в контакт с интересующим патогенным стимулом. Или вот другой пример: по РНК, выделяемой из эмбрионов данио-рерио и мышей на разных этапах после зачатия, можно отслеживать динамику профилей экспрессии генов, направляющую клетку по тому или иному пути специализации.

Секвенирование РНК – одна из множества технологий, опирающихся на секвенирование ДНК[57]. Сегодня ученые уже умеют определять, какие сегменты ДНК намотаны на гистоны, к каким нуклеотидам прикреплены метильные группы, какие участки генома покрыты факторами транскрипции и многое другое. В заголовке мы спросили: «Когда секвенатор ДНК не соответствует своему названию?» И каков же ответ? Когда он секвенирует РНК, или когда картирует элементы упаковки ДНК, или когда исследует регуляцию работы генов, да вообще много когда.

Живые существа постоянно обрабатывают информацию, закодированную в ДНК: они копируют ее при делении клеток и рутинно считывают, транскрибируя и транслируя гены в РНК и белки. Результаты этих процессов зависят от последовательности нуклеотидов A, Ц, Г и T, то есть сами процессы в каком-то смысле сводятся к чтению молекул ДНК. Примерно 4 миллиарда лет других методов чтения ДНК не существовало. Теперь мы изобрели радикально новые инструменты – быстрые, дешевые, едва ли не сказочно эффективные, – и они открывают нам доступ к информации, зашифрованной в каждом организме. Эта поразительная технологическая трансформация случилась потому, что мы серьезно подошли к осязаемым физическим характеристикам биомолекул и наладили их взаимодействие с другими аспектами наших технологий. Ну а мы теперь посмотрим, что можно узнать из информации, зашифрованной в ДНК.

На третий день после зачатия каждый из нас состоял всего из 6–10 клеток (см. рисунок). Если бы одну из них тогда изъяли, с нами ничего бы не случилось, хоть на том этапе одна клетка и была существенной долей целого. В этом снова проявляются чудеса самосборки вроде тех, что мы видели в главе 7: оставшиеся клетки и их потомки заполняют пустоты, реагируют на стимулы в соответствии с их местоположением, а не происхождением и формируют в итоге характерный для организма клеточный ансамбль. Извлечь клетку можно с помощью тонких пипеток под микроскопом, как показано на рисунке: удерживая эмбрион одной пипеткой, аккуратно всасывать единичную клетку в другую. Но можно и подождать еще несколько дней, пока клеток не станет около сотни. В этот момент они уже разделены на две легко различимые группы: на скопление, из которого сформируется зародыш, и оболочку, которая станет плацентой. Если взять с периферии десяток клеток, мы получим геном будущего ребенка, при этом клетки – предшественницы зародыша даже не затронем. В сравнении с забором одной клетки, после этой процедуры останется меньше времени до имплантации эмбриона в тело матери, поэтому геномный анализ придется провести быстро. Впрочем, как мы видели, чтение ДНК на современных платформах постоянно ускоряется. Оба подхода позволяют нам собрать клетки, которые расскажут о генетическом устройстве каждого эмбриона из когорты.

Если у нас, как это часто бывает, получится больше одного жизнеспособного эмбриона, мы, в принципе, можем воспользоваться информацией, добытой путем биопсии с анализом зародышевой ДНК, чтобы сознательно выбрать эмбрион для имплантации, а не полагаться на случай¹⁶. Например, сегодня уже распространен пренатальный скрининг высокой предрасположенности к моногенным заболеваниям вроде муковисцидоза. Представьте, что у вас есть три эмбриона: геном одного из них содержит ведущую к муковисцидозу мутацию в гене ионного транспортера, а геномы двух других ее лишены. Все три зародыша одинаково неестественны, поскольку получены в результате ЭКО, и одинаково естественны, поскольку сформированы из обычных для природного зачатия комбинаций родительских геномов. Никакого геномного редактирования мы не используем, ничего в ДНК не меняем, но все равно у нас есть элемент выбора: мы сознательно отдаем предпочтение одному из геномов.

Некоторые болезни диагностировать еще проще. Геном животных, как упомянуто в главе 3, представляет собой не одну непрерывную нить ДНК, а совокупность крупных фрагментов, называемых хромосомами. У человека 46 хромосом (23 пары), но из-за ошибок при делении в половую клетку иногда попадает на одну хромосому меньше или больше. Обычно это приводит к гибели зародыша, но не всегда. Например, синдром Дауна развивается, когда у плода оказывается не две, а три 21-х хромосомы. Избыток генетического материала проявляется излишками белков, кодируемых генами 21-й хромосомы, и в результате мы наблюдаем целый спектр симптомов дисфункции нервной и других систем. Обнаружить лишнюю хромосому или выпадение нужной довольно просто. Это не требует ни ЭКО, ни изъятия клеток из эмбриона. При беременности в результате обычного зачатия можно взять образец амниотической жидкости, окружающей плод: в ней более чем достаточно отшелушенных клеток зародыша, чтобы мы могли изучить его генетический багаж.

Хотя геномный анализ эмбрионов in vitro позволяет отбраковывать тех из них, что содержат очевидные генетические детерминатны патологий (моногенных или хромосомных), справится ли он с более сложными признаками? В теории – да. На практике – есть нюансы.

Как мы узнали, генетический компонент многих заболеваний исчисляется тысячами генов, и эти ансамбли выявляют в современных работах по генетическому картированию. Мы умеем распознавать редкие высокорисковые геномы – скажем, 1 из 200 геномов, соответствующий пятикратному увеличению предрасположенности к ИБС, то есть уровню, который заставляет бить тревогу при скрининге моногенных факторов. Поэтому такие экстремальные риски вполне возможно учитывать в современной эмбриональной селекции, и тогда вместо диагностики и лечения мы будем профилактировать болезни – действуя по тому же принципу, что в примере с тремя эмбрионами чуть выше. Отмечу, однако, что в подавляющем большинстве случаев ни один из эмбрионов не продемонстрирует высокого риска – отклонения, способные подтолкнуть нас к отбраковке, встречаются крайне редко. Ни числа, ни метод я не выдумывал: распространенность и степень риска развития ИБС я взял из опубликованного в 2018 году исследования ОНП, о котором уже упоминал.

Кажется, что, раз можно выбирать эмбрионы, не обладающие опасными признаками, то можно выбирать и эмбрионы, обладающие желательными. Но это не так. Симметрию нарушает сама природа случайности. В качестве примера снова возьмем рост, хотя та же логика применима и к цвету волос, интеллекту и любой другой характеристике с сильным наследственным компонентом, распределенным по множеству точек генома. Когорта из трех эмбрионов представляет три из несметного числа вариантов генетических перетасовок, которые могли произойти. Это три разных серии подбрасывания 10 тысяч монет, символизирующих примерно 10 тысяч генетических факторов определения роста. Возможно, в одной из серий у вас выпадет 10 тысяч решек – родится исключительный ребенок ростом на 30 сантиметров выше среднего, – но вероятность этого исчезающе мала. Гораздо более вероятно, что решек выпадет 4987, или 4672, или 5115. Мы действительно можем выбрать из трех эмбрионов тот, у которого будет больше генетических вариантов, располагающих к высокому росту (случай с 5115 решками в нашей монетной аналогии), но их эффект будет лишь частью скоординированного совокупного влияния 10 тысяч вариантов, да еще и сгладится негенетической изменчивостью. Проводить скрининг для выбраковки экстремального генома в маловероятном случае его появления – это совсем не то же самое, что надеяться выловить исключительный геном среди нескольких случайных.

К подобным выводам приходят и в более детальных исследованиях. В 2019 году группа Шая Харми из Еврейского университета в Иерусалиме опубликовала результаты своей работы, выявившей, что при современном состоянии технологий и баз данных отбор эмбрионов может дать преимущество в росте примерно в 2,5 сантиметра и преимущество в IQ где-то в 2,5 балла – иными словами, метод лишь «ограниченно полезен»¹⁷.

Возможность корректировать черты будущего ребенка одновременно восхищает и пугает, и неудивительно, что мысль о «дизайнерских детях» так будоражит общественность. Эмбриональный отбор сопряжен с глубокими этическими проблемами, исчерпывающее обсуждение которых вылилось бы в несколько книг. Моя задача состоит не в том, чтобы разобрать по косточкам всю повестку биоэтики, а в том, чтобы описать науку, которая должна обосновывать наши решения относительно уместности и способов применения тех или иных новых биотехнологий. И все же было бы большим упущением не обозначить хотя бы несколько проблемных моментов.

Идея об управлении формированием будущих людей имеет долгую и удручающую историю. Самым зловещим ее выражением стала нацистская философия геноцида, но этой идее нашлось применение и в формально свободных демократиях начала XX века. Например, в некоторых штатах США людей, признанных «слабоумными», подвергали принудительной стерилизации: в 1927 году решение Верховного суда легализовало эту процедуру на всей территории страны. К 1939 году в Штатах принудительно стерилизовали около 30 тысяч человек¹⁸. Подобные законы действовали и в нескольких других странах. Адепты евгеники были уверены, что такие действия идут на пользу обществу и способствуют благополучию человечества¹⁹. Судья Верховного суда США Оливер Уэнделл Холмс писал: «Мы видели не раз, как стремление к общественному благу требовало от лучших наших граждан жертвовать собственной жизнью. Было бы странно, если бы оно не могло требовать меньших жертв от тех, кто и так подрывает силы государства и зачастую даже не воспринимает это как жертвы. <…> Принцип, на котором зиждется обязательная вакцинация, достаточно широк, чтобы охватить и вырезание фаллопиевых труб»[60]. Какие бы аргументы ни приводили сторонники принудительной стерилизации, на практике ее обычно применяли к беднякам и людям, так или иначе не вписывавшимся в принятые общественные рамки. Ничем не подкрепленные оценки моральных или интеллектуальных качеств служили удобным основанием для ущемления прав тех, кого считали недостойными. Нацисты же довели концепцию генетической выбраковки до инфернальной крайности. Оба исторических примера необходимо постоянно держать в уме при принятии сегодняшних решений – в силу их сходств и различий друг с другом и с новыми реалиями.

Одно из ключевых отличий нашего времени в том, что инструментарием эмбрионального отбора, по крайней мере сейчас, управляют индивиды, а не государство: будущие родители сами принимают репродуктивные решения, не выходящие за рамки закона. Но здесь появляется другая проблема – проблема доступности: не будет ли технология отбора эмбрионов несоизмеримо больше служить богатым? Это опасение справедливо в отношении всех технологий здравоохранения, включая ЭКО, и развеять его можно снижением стоимости медуслуг и обеспечением широкого доступа к ним. Эмбриональный отбор пересекается и с более общими вопросами об отношениях между родителями, детьми и обществом. Так, большинство людей считает, что родители имеют право оплачивать спортивные секции, уроки музыки и занятия с репетитором для своих детей. Но нам совсем неочевидно, синонимичны ли пренатальные улучшения таким вот преимуществам, даруемым более обеспеченными родителями, или же они категорически отличаются и нам необходимо информированное обсуждение этой темы.

Даже если эмбриональный отбор практикуется на уровне индивидуальных решений, он может менять общий состав населения чисто за счет сокращения передачи генетических вариаций будущим поколениям. Разумеется, мы и так уже влияем на генофонд, выбирая себе партнеров, и генетический анализ популяций выявляет признаки «ассортативного скрещивания», то есть объединения в пары людей со сходным уровнем образования и социально-экономическим статусом²⁰. Эмбриональный отбор в каком-то смысле делает это влияние более осознанным. Если отпустить экстраполяцию на волю и представить, что однажды уже не родится ни одного ребенка с высокорисковыми в отношении рака груди мутациями генов BRCA1 и BRCA2, это будет означать изъятие соответствующих генетических вариантов из генофонда будущих поколений. Потенциальные выгоды этого очевидны, но могут быть и минусы. Не исключено, хотя и маловероятно, что эти аномальные варианты могут приносить пользу в каком-то непредвиденном контексте – например, снижать восприимчивость к инфекции, если в будущем начнется какая-то непривычная эпидемия. Но вероятнее, удручающей окажется утрата самих признаков, которые мы выбраковываем. Никто не будет возражать, если мы навсегда распрощаемся с раком молочной железы, но как насчет синдрома Дауна, который, несмотря на все налагаемые им проблемы, часто совместим с насыщенной и счастливой жизнью? Многие выдающиеся по красоте и остроумию произведения создали люди, страдающие депрессией, которая имеет отчасти наследственную природу. Избавлением от таких расстройств мы можем обеднить человечество, сократив генетическое разнообразие в угоду какой-то узкой концепции нормальности. Проблему усложняют и вопросы о том, что общество считает «нормальным» и кто это решает. С другой стороны, вряд ли кто-то будет проповедовать намеренное увеличение доли населения с синдромом Дауна или депрессией. Но тогда желательно бы обосновать, почему статус-кво оптимален. И наконец, даже если мы дружно признаём важность сохранения генетической изменчивости человека, мы все равно слышим отголоски евгенического прошлого в представлении о том, что репродуктивная автономия вторична по отношению к общему благу. Это исключительно сложные темы для размышления. Я призываю читателя не отворачиваться от них, какими бы тревожными они ни были, поскольку их и без того существенная значимость для общества будет только расти.

Индивидуалистическая природа эмбрионального отбора подчеркивает важность просвещения. Как мы увидели, концепции изменчивости, неопределенности, случайности и даже сама природа генов и генетических признаков исключительно важны для понимания того, что мы можем и чего не можем делать с помощью современных инструментов. Если что-то из этого мы трактуем неверно, у нас могут возникнуть ложные надежды и необоснованные ожидания, за которые, возможно, придется отдуваться будущим поколениям. Просвещение жизненно важно. Это, пожалуй, наименее противоречивое утверждение во всей биоэтике, но сложно сказать, как и когда это просвещение внедрять. Лично я уверен, что представления о клетках, генах, развитии и технологиях должны входить в багаж знаний любого образованного человека, а не всплывать лишь в ходе консультаций в центрах репродуктивной медицины.

Все перечисленные выше вопросы важны, интересны и неординарны. Ни один из них, однако, не связан с генной инженерией и не предполагает внесения изменений в саму ДНК. Благодаря одному только знанию о возможных и реальных физических перестройках геномов вкупе с инструментами для работы с клетками и чтения ДНК мы теперь учимся изменять живое такими способами, о которых прошлое поколение и помыслить не могло. Умение переписывать ДНК открывает нам совершенно новые возможности. О нем и поговорим в следующей главе.

Некоторые колечки закрываются и без целевого гена, но вскоре мы увидим, что такие пустышки не играют роли. Главное, что нужная нам последовательность оказывается хотя бы в нескольких плазмидах. (Если приглядеться к рисунку, в остове ДНК можно заметить зазоры в точках соединения липких концов; они исчезают, когда бактериальный фермент ДНК-лигаза сшивает стыкующиеся нуклеотиды вставки и плазмиды.)

Далее необходимо доставить плазмиды в бактериальные клетки. Поглощение ДНК из среды – трансформация – само по себе происходит редко, но его можно стимулировать тепловыми или электрическими импульсами, которые открывают в бактериальной оболочке врéменные поры. И все же лишь у небольшой доли бактерий внутри окажутся исходные либо рекомбинантные (со встроенным геном) кольца ДНК. Можно, однако, провести отбор в пользу именно этих микробов, уничтожающий всех остальных. Ученые выбирают или создают плазмиды, содержащие полезные для работы гены, в том числе и те, что обеспечивают устойчивость хозяйской клетки к антибиотикам. Если бактерии после этапа трансформации поместить в среду с антибиотиком, в живых останутся лишь клетки с плазмидами. Если таких клеток мало, не беда: в питательном бульоне они превратятся в миллиарды. Разумеется, в части выживших бактерий окажутся плазмиды без вставки, но нехитрые техники определения размера или последовательности плазмидной ДНК позволят выявить и отбраковать такие варианты. В итоге мы будем размножать только правильные бактериальные клоны².

По завершении всех описанных этапов ученые получают организм, которого не существовало прежде: бактерию, несущую и экспрессирующую чужеродный ген. В 1973 году лаборатории Стэнли Коэна из Стэнфордского университета и Герберта Бойера из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, работавшие над совместным проектом, объявили о первой успешной бактериальной трансформации³. Вскоре стал очевиден потенциал этого открытия: бактерии можно превращать в микроскопические конвейеры, производящие не свойственные им вещества. Поскольку инсулин был самой привлекательной целью, несколько лабораторий вступили в биоинженерную гонку, стремясь как можно скорее сконструировать бактериальных продуцентов этого гормона.

Группа Уолтера Гилберта из Гарвардского университета – того самого Гилберта, пионера секвенирования ДНК из главы 13, – получала ген инсулина из очищенной человеческой ДНК, но такой подход строго регламентировался. Из-за всеобщих опасений по поводу межвидового перемещения генов бурные дебаты в городском совете массачусетского Кембриджа, где находится Гарвардский университет, завершились введением моратория на все подобные работы. Один из членов совета позже сказал: «Я попытался разобраться в научной подоплеке, но пришел к выводу, что не способен дать обоснованную оценку риска. Когда я понял, что не могу решить, голосовать ли в пользу или против моратория, на научных основаниях, я обратился к политическим»⁴. Он выступил за введение моратория.

Тем временем в импровизированной лаборатории в нескольких километрах к югу от Сан-Франциско небольшой биотехнологический стартап вовсю использовал химически синтезированный инсулиновый ген, избегая нормативных и социальных коллизий, присущих работе с молекулами из человеческого организма. Атомное устройство нуклеотидов абсолютно идентично вне зависимости от способа их создания – молекула есть молекула, – но закон и общественность не всегда готовы это признать. Упомянутую молодую компанию, Genentech, основали Герберт Бойер и венчурный капиталист Роберт Суонсон. В августе 1978 года в ее биореакторах удалось впервые в истории получить человеческий инсулин бактериального происхождения⁵. Маленькая Genentech оформила партнерство с фармгигантом Eli Lilly, чтобы организовать клинические исследования, наладить масштабное производство и получить одобрение регуляторов здравоохранения. В 1983 году инсулин от Genentech вышел на рынок, фактически совершив революцию в лечении диабета и став первым генно-инженерным лекарственным препаратом для людей.

Бактериальное производство инсулина проторило путь к биологическому получению лекарств от широкого спектра заболеваний. Сегодня объем рынка биологических препаратов медицинского назначения превышает 250 миллиардов долларов. Инсулин, как и многие другие вещества, теперь производят в основном генетически измененные дрожжи, а не бактерии⁶. Дрожжи – тоже одноклеточные организмы, но они, как и мы, эукариоты. С дрожжами нас роднит целый ряд недоступных бактериям механизмов модификации белков. Инсулин синтезируется в нашей поджелудочной железе как единая аминокислотная цепь (см. главу 2), которая впоследствии разрезается на три части; две крайних части объединяются мостиком новой химической связи, а средняя выпадает. Бактерии не способны к таким химическим операциям, поэтому исследователи из Genentech закодировали два крайних фрагмента отдельными генами, чьи белки затем соединялись друг с другом. Метод с использованием дрожжей не столь заковырист и более продуктивен.

Чтобы научиться внедрять гены в эукариотические клетки, потребовались дальнейшие исследования и изобретения. Лишь немногие из эукариот имеют плазмиды, и эукариотические гены, как правило, встраивают в хромосомы, чтобы они надежно экспрессировались в составе общего генома. (Такой вариант модификации иногда предпочитают и в бактериальной инженерии: внедрение нужного гена в хромосому бактерии дает больше гарантий на его сохранение, поскольку плазмиды могут теряться при клеточных делениях.) Методы модификации эукариотических геномов развивают уже не один десяток лет, однако до недавнего времени они были неэффективными, неточными и трудоемкими. Все радикально изменилось лишь с появлением системы CRISPR/Cas9, поэтому я не стану подробно разбирать другие подходы, а ограничусь лишь общим обзором их тактики и примеров, где приложение таких усилий может быть оправданным.

Если представить эукариотический геном как огромную библиотеку с закрытым фондом – вроде Библиотеки Конгресса или частного собрания, – то наша задача состоит в том, чтобы как-то втиснуть на полку новую книгу. Мы могли бы оставить ее в общественном зале, но библиотекарь вряд ли отнесет ее на полку за дверью: эукариотические клетки не поглощают и не встраивают в свои геномы случайные обрывки ДНК. Наши шансы увеличиваются, когда библиотеку ремонтируют или перевозят на новое место, поскольку в суматохе нашу книгу могут подложить к остальным. Такую возможность предоставляют только что оплодотворенные яйцеклетки, пока в них не объединились родительские хромосомы. Если микроинъекцией ввести молекулы ДНК в формирующийся зародыш, они могут встроиться в геном⁷. Сразу после разработки эта техника редко оказывалась успешной и позволяла внедрять фрагмент ДНК лишь в случайные места генома, ставя под угрозу целостность генов. Дальнейшие усовершенствования повысили ее эффективность и даже привнесли во внедрение ДНК некоторую степень прицельности (таргетированности). Сейчас это стандартный метод создания трансгенных мышей, например, с генами флуоресцентных белков для слежения за клеточными функциями (см. главу 2).

Другой вариант решения библиотечной задачи – привлечь кого-то, кому будет легче проникнуть в библиотеку, – например, профессионального взломщика. Мы часто прибегаем к помощи вирусов. Вирусы запускают свои геномы в клетки и реплицируют их там либо в виде независимых молекул, либо в составе генома хозяина. Маленькие и проворные вирусы не склонны брать дополнительный груз, но немного лишнего генетического материала в них все же можно втиснуть, и тогда модифицированные вирусные частицы доставят его в клетки заражаемого организма. Вирусная доставка ДНК имеет преимущества перед микроинъекцией, поскольку все делает сам вирус, а не лаборант с тонкой иглой, и работать можно с разными типами клеток, а не только со свежеоплодотворенной яйцеклеткой. Но у этих методов сходные недостатки: они не особенно надежны и таргетны, то есть избирательность встраивания привнесенной вирусом ДНК невысока. Когда мы создаем трансгенных мышей, нам неважно, что доля успешных процедур далека от идеала. Мы проводим отбор и дальше изучаем только правильно трансформированных мышей. Но если мы хотим разработать лекарственный препарат для человека, наши требования к надежности и точности сильно ужесточаются.

Бактерии – даже те немногие из них, которые могут проникать в другие клетки и причинять им вред, – обычно не изменяют геномы эукариот. Но есть и редкие исключения. Почвенный микроб Agrobacterium tumefaciens заражает корни растений, когда у него появляется такая возможность. Эта бактерия отрезает особый фрагмент своей плазмидной ДНК (Т-ДНК) и вводит его в растительную клетку вместе с белками, которые направляют Т-ДНК в ядро и вынуждают растение задействовать механизм репарации (починки) ДНК, чтобы внедрить бактериального засланца в свой геном. В итоге синтезируются закодированные в Т-ДНК вещества, провоцирующие опухолеобразование на корнях и питающие бактерий⁸. Ученые создали модифицированную агробактерию, в которой опухолеродные гены можно заменять любыми допустимыми по размеру ДНК-фрагментами, превращая вредоносный организм в мощный и безопасный инструмент доставки генов в клетки растений.

Один из самых интересных примеров доставки ДНК с помощью Agrobacterium – генетическая модификация риса для борьбы с дефицитом витамина A. Недостаток этого витамина считается главной предотвратимой причиной детской слепоты: ежегодно он отбирает зрение у 250–500 тысяч детей⁹. Почти половина этих детей умирает в течение года после потери зрения, что становится трагическим подтверждением важности витамина A для здоровья в целом. Наш организм получает витамин A из некоторых продуктов животного происхождения и производит из разных предшественников, в том числе из бета-каротина, который придает оранжевый цвет овощам вроде моркови и батата. Бета-каротина, однако, нет в рисе, который благодаря своей дешевизне и обилию на рынке служит основным продуктом питания во многих регионах, где распространен дефицит витамина А. Побеги риса вообще-то способны производить бета-каротин: он синтезируется в листьях, где участвует в фотосинтезе. Но соответствующие гены не экспрессируются в крахмалистых зернах, которые мы как раз и едим.

Чтобы решить эту проблему, ученые под руководством Инго Потрикуса из Швейцарской высшей технической школы и Петера Бейера из Фрайбургского университета в Германии создали «золотой рис»: добавив в геном обычного риса два гена – из нарцисса и бактерии – с работающим только в зернах промотором, они обеспечили синтез бета-каротина в съедобной части растения¹⁰. Над этим проектом работали несколько лет и об успехе объявили в 2000 году. Дальнейшие улучшения[63], проведенные уже совместно с биотехнологическим гигантом Syngenta, вылились в 23-кратное повышение количества бета-каротина в золотом рисе. Впоследствии Syngenta передала связанные с этим продуктом патенты, технологии и трансгенные семена населению нуждающихся в нем стран.

Клинические исследования показали, что желто-оранжевый рис безопасно и эффективно поставляет в организм человека бета-каротин, который преобразуется в витамин A¹¹. Американское общество питания отметило, что «очень небольшое количество – возможно, чашка – золотого риса способно обеспечивать 50 % рекомендуемой суточной нормы потребления витамина A». Несмотря на это, внедрение золотого риса в аграрную практику идет исключительно медленно из-за противодействия всевозможных объединений противников генетически модифицированных организмов (ГМО)¹². В последние годы, в частности, критика направлена не столько на само растение, полезность которого сложно отрицать, сколько на то, что выращивание такого риса даст зеленый свет внедрению других ГМ-продуктов; и вообще, лучше бы бедные получали витамин А из более богатого питательными веществами рациона. Но все же наметились некоторые подвижки. В 2019 году Бангладеш, где от дефицита витамина A страдает 21 % детей, первой из стран одобрила посев семян золотого риса¹³. На Филиппинах доля таких детей в возрастной категории от шести месяцев до пяти лет за период с 2008 по 2013 год выросла с 15 до 20 % – а это тысячи обреченных на слепоту и смерть. В 2019 году Филиппины, признав безопасность употребления золотого риса, подготовили фундамент для его возделывания[64]. Золотой рис появился 20 лет назад, но споры о нем, как и о других ГМ-культурах, не угасают по сей день, подпитываясь в некоторых случаях научными знаниями, в некоторых – сложными торгово-экономическими соображениями, а во многих – расплывчатыми представлениями и частными мнениями. И конечно, более свежие технологии открывают еще больший простор для дискуссий.

Итак, мы уже не один десяток лет умеем изменять геномы всевозможных организмов. Но описанные выше методы лишены притягательной простоты. Организм включает в себя новый ген лишь после серии проб и ошибок, и место, где он окажется, либо не контролируется вовсе – а это непредвиденно влияет на экспрессию, – либо контролируется умеренно, но ценой еще более трудоемкой инженерии. Когда мы задались целью внедрить ген инсулина или флуоресцентного репортера в бактерию или мышь, пытаться сделать это идеально, пожалуй, можно не раз и не два, но такая стратегия пригодна не везде, особенно если мы мечтаем о лечении генетических болезней человека. Нам хотелось бы придумать простой и точный способ редактировать геномы: находя специфические последовательности ДНК, либо заменять их нужными фрагментами собственного изготовления, либо просто аккуратно вырезать из генома. И теперь у нас такой способ есть. Я рассмотрю систему CRISPR/Cas9, однако, как это часто бывает с технологиями, почти одновременно появились несколько революционных методов геномного редактирования. Альтернативные варианты – нуклеазы на основе белков с доменом «цинковые пальцы» (ZFN) и нуклеазы на основе эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEN), – не могут сравниться с CRISPR/Cas9 по скорости, дешевизне и простоте применения¹⁴. Я упоминаю их исключительно ради полноты картины и чтобы дать читателю представление об атмосфере начала XXI века, насыщенной семенами идей о редактировании генома, которые готовы были вот-вот прорасти.

CRISPR/Cas9 – очень древняя или, напротив, совсем новая техника. Ее, возможно, открыли, а возможно, изобрели. Любой из этих вариантов может оказаться верным в зависимости от ракурса. Сначала посмотрим, как этим геномным инструментом оперируют его исконные обладатели, а затем обратимся к его современным версиям на службе у человека.

Природа, если воспользоваться образом Теннисона, была красна от клыков и когтей задолго до появления этих самых клыков и когтей. Даже микроорганизмы борются друг с другом. Бактерии пронзают и травят своих сородичей, амебы пожирают бактерий, вирусы заражают клетки и бесчинствуют в их геномах. Помимо вооружения у каждого из этих созданий вырабатывается защита. До недавних пор считалось, что защитные механизмы бактерий работают только в настоящем, выявляя угрозы по мере их возникновения и не запоминая прошлые обиды. Но теперь мы знаем, что бактерии обладают памятью. Как и клетки нашей иммунной системы, они ведут учет уже знакомых противников, чтобы незамедлительно среагировать при новой встрече с ними. Само открытие адаптивного бактериального иммунитета может служить символом нашего биотехнологического века, ведь оно не состоялось бы без внедрения секвенирования ДНК и современных компьютеров.

В 1987 году японские биологи, изучавшие один из генов модельной бактерии E. coli, мимоходом заметили у нее «необычную структуру» – последовательность из 29 нуклеотидов, которая повторялась в геноме пять раз через равные 32-нуклеотидные интервалы (спейсеры)¹⁵. Каково ее назначение и встречается ли она в других геномах, так и осталось загадкой. На это наблюдение особо не обратили внимания: жизнь полна странностей, по большей части не имеющих никакого значения.

В 1990-х Франсиско Мохика и его коллеги из испанского Университета Аликанте обнаружили похожие повторы ДНК в геномах нескольких архей¹⁶. Археи – это тоже одноклеточные микроорганизмы, лишенные ядер и мембранных органелл (см. главу 5). Внешне они малоотличимы от бактерий, но формируют отдельную ветвь древа жизни: как и нас, их отделяют от бактерий миллиарды лет эволюции. Мохика наткнулся на статью японцев и понял, что закрепление похожих генетических структур у столь неродственных организмов должно свидетельствовать о важности их роли в жизни микробов. В конце 1990-х, когда количество прочитанных бактериальных геномов возросло, а вычислительные инструменты позволили возиться с их сиквенсами на обычном компьютере, Мохика с коллегами нашел похожие расположенные кластерами повторы в геномах многих других бактерий и архей. Впрочем, их многочисленность и загадочность не принесли лаборатории Мохики славы и денег: она годами не могла добиться финансирования этих исследований, причем отказы обычно обосновывали ничтожной значимостью ДНК-повторов. А содержащих их геномов между тем становилось все больше. В 2002 году Мохика и Рууд Янсен из Утрехтского университета предложили назвать эти геномные структуры CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами». Ученые заметили и то, что вплотную к этим структурам примыкает серия генов, которые назвали Cas (CRISPR-associated, «ассоциированные с CRISPR»). Итак, CRISPR получили имя, однако их функции по-прежнему оставались тайной.

И снова на помощь пришли геномы и компьютеры. Сразу три статьи 2005 года – одна от группы Мохики и две другие из Франции, от команд Кристин Пурсел и Александра Болотина¹⁷ – сообщали, что нуклеотидные последовательности спейсеров в CRISPR совпадают чаще всего с участками геномов вирусов[65]. С незапамятных времен вирусы заражали клетки, и такое совпадение позволяло заподозрить в CRISPR элементы неизвестного прежде защитного механизма. Хотя внимание к этой теме постепенно нарастало, ни одну из трех работ сначала не оценили по достоинству. Статью Мохики, написанную первой, один за другим отвергли все престижные журналы, и ей пришлось найти более скромный приют. Тем не менее сущность CRISPR начинала вырисовываться. Зачем бережно хранить каталог ДНК-фрагментов заражавших тебя вирусов? Не иначе как для узнавания по этим «фотороботам» и обезвреживания вторженцев, если они решат атаковать тебя вновь[66].

Работая в качестве бактериальной иммунной системы, CRISPR/Cas использует комплементарность ДНК и РНК (см. главу 3), а также нуклеазную активность белков (способность расщеплять ДНК)¹⁸. Белки Cas1 и Cas2 разрезают обнаруженные ими в клетке чужеродные, скорее всего вирусные, молекулы ДНК и вставляют фрагменты в клеточный геном – в самое начало CRISPR-кассеты, добавляя заодно и новый повтор. Таким образом получается, что повторы разграничивают отдельные фрагменты (спейсеры) в библиотеке знакомых клетке вирусных геномов. Далее клетки совершают, казалось бы, безрассудный поступок и транскрибируют цепочку повторов и спейсеров в молекулу pre-crРНК (предшественницу CRISPR-РНК). Как вы помните из главы 3, транскрипция обычно служит первым шагом к синтезу белков, а синтез вирусных белков для клетки может быть опасен. РНК повторов, однако, частично комплементарна tracrРНК (trans-activating crRNA), которая считывается с участка генома поблизости от CRISPR-локуса. Каждый повтор в pre-crРНК спаривается с tracrРНК, после чего с каждым из этих РНК-дуплексов связывается белок Cas9, а особый фермент нарезает pre-crРНК на отдельные crРНК, состоящие из одного спейсера и части повтора. Так образуется набор связанных с Cas9 и скрученных в двойную спираль crРНК/tracrРНК-гибридов со свободно висящим сегментом вирусного происхождения (см. среднюю часть рисунка).

Комплекс РНК-Cas9 бродит по клетке благодаря броуновскому движению. Если среди встречных молекул ДНК ему попадается та, что содержит специфическую короткую и довольно распространенную последовательность нуклеотидов (PAM, protospacer adjacent motif), он прикрепляется к ней в этом самом месте (кстати, та же последовательность помогает Cas1 и Cas2 определять, где разрезать чужеродную ДНК для включения в CRISPR-кассету). Cas9 расшатывает связи между нитями ДНК, по сути расплавляя двойную спираль на небольшом участке. Если однонитевая РНК, которую переносит Cas9, комплементарна одной из распаренных нитей ДНК – а это возможно только с ДНК того же вируса, по фрагменту которого сформирована crРНК, – образуется ДНК-РНК-гибрид. Эта необычная, но стабильная двойная спираль занимает в Cas9 бороздку, «выстланную» положительными электрическими зарядами, которые удерживают сильно электроотрицательные ДНК и РНК на месте (см. нижнюю часть рисунка; ДНК обозначена черным).

Cas9 содержит два нуклеазных домена, способных расщеплять ДНК. Когда белок захватывает ДНК-РНК-спираль, домены меняют ориентацию так, чтобы каждый из них контактировал с одной из нитей вирусной ДНК – той, что соединилась с РНК, и той, что осталась в одиночестве. На рисунке ниже я показал самое радикальное изменение формы, где один из доменов, черная спираль, поворачивается почти на 180 градусов. Cas9 вносит в каждую нить по разрезу, и эта часть вирусного генома теряет функциональность. Белок удаляется: его дело сделано¹⁹.

Существуют разные системы CRISPR с разными наборами ассоциированных с ними белков, но я не буду углубляться в это²⁰. Базовый механизм сходен у всех, и потому я сосредоточусь на относительно простом и изящном белке Cas9, который эксплуатируют в большинстве биотехнологических проектов.

CRISPR/Cas9 как бактериальная иммунная система весьма впечатляет, ведь в ней память совмещается с защитой. На своем глубинном уровне она показывает, что миллиарды лет назад Природа решила одну из главных задач генной инженерии: научилась находить целевую последовательность нуклеотидов среди миллионов прочих и вносить в нее изменения. Поиск здесь подразумевает пользование библиотекой вирусных ДНК, а изменение – простое уничтожение расщеплением. Некоторые ученые, однако, догадались, что природные разработки можно подправить, чтобы расширить область их применения и даже сделать их созидательными.

В 2012 году группы Дженнифер Даудны из Калифорнийского университета в Беркли и Эмманюэль Шарпантье из Университета Умео в Швеции опубликовали написанную по итогам совместной работы статью, оказавшую мощнейшее влияние на научное сообщество. Авторы изящно демонстрировали редактирующие способности CRISPR/Cas9 за пределами клеток бактерий и архей. Команда Шарпантье открыла tracrРНК и объяснила многие аспекты работы Cas9. Даудна и ее коллеги специализировались на РНК, но в диапазон их исследовательских объектов входил и сложный ландшафт CRISPR-ассоциированных белков. В естественных условиях tracrРНК и crРНК, созданная на базе вируса, вместе направляют Cas9. Даудна и Шарпантье поняли, что заменой вирусной последовательности любой другой можно перепрограммировать Cas9 на желаемый пункт назначения. Кроме того, вместо tracrРНК и crРНК можно использовать соответствующим образом сконструированный и сворачивающийся единый РНК-гид. Следовательно, всего одной легкосинтезируемой нитью РНК и всего одним легкопроизводимым белком Cas9 можно обеспечить точное нацеливание на нужные участки ДНК. Чтобы разрезать ДНК там, где находится определенная последовательность нуклеотидов, надо действовать по следующей инструкции: создать молекулы единого РНК-гида, содержащие ту самую последовательность (вместо T там должны стоять У, как всегда в РНК), добавить к ним Cas9, поместить весь комплекс в интересующую вас систему – и все. Две научные группы показали, что этот метод работает в пробирке, за пределами естественной для него среды микробных клеток. Сообщая о результатах экспериментов в статье 2012 года, авторы назвали получившуюся систему «эффективной, многофункциональной и программируемой» и добавили, что она обладает «солидным потенциалом для решения задач прицельного воздействия на гены и редактирования геномов»²¹.

Статья Даудны и Шарпантье, представленная на рассмотрение в престижный журнал Science 8 июня 2012 года и опубликованная онлайн 28 июня, привлекла огромное внимание: было очевидно, что в ней описано открытие с грандиозным потенциалом. Исследовательницы получили по 3 миллиона долларов, став в 2015 году лауреатами Премии за прорыв в области естественных наук, учрежденной Марком Цукербергом из Facebook[67], Сергеем Брином из Google и другими титанами технологий. Церемония вручения премии проходит ежегодно среди знаменитостей в Кремниевой долине²².

Но вернемся в 2012 год. Исследовательская группа, возглавляемая Виргиниюсом Шикшнисом из Вильнюсского университета, 6 апреля представила в научный журнал свою статью, где тоже описывала процесс расщепления ДНК in vitro системой CRISPR/Cas9 с проводником в виде вариации tracrРНК/crРНК, но не единой молекулы, а двух РНК-фрагментов²³. Статья завершалась сходным выводом: полученные результаты «прокладывают путь к разработке универсальной, программируемой, направляемой РНК» платформы для манипуляций с ДНК. Рукопись бесцеремонно отвергли, и авторы отправили ее в другой журнал. В итоге работу опубликовали лишь в конце сентября, на три месяца позже статьи Даудны и Шарпантье. В науке признание обычно достается тому, кто пришел к финишу первым, и Шикшниса порой называют «забытым человеком CRISPR». Правда, в 2018 году он разделил с Даудной и Шарпантье премию Кавли в области нанотехнологий, размер которой составлял миллион долларов США²⁴. Не приходилось сомневаться, что открытие CRISPR принесет кому-то Нобелевскую премию, вопрос был только, кому и когда. Ответ получили в 2020-м: нобелевскими лауреатами в области химии стали Даудна и Шарпантье.

После первых статей 2012 года появилось множество других, написанных разными научными группами. Так, в 2013-м лаборатории Фэна Чжана (Институт Эли и Эдит Броуд при Массачусетском технологическом институте и Гарварде) и Джорджа Чёрча (Гарвардская медицинская школа) продемонстрировали работу CRISPR/Cas9 в культурах клеток мышей и человека²⁵. Подобно грибам после дождя, в прессе то и дело появлялись материалы, рассчитанные на широкую публику: к 2019 году одна только The New York Times опубликовала больше 100 статей с упоминанием CRISPR. Можно еще многое рассказать об истории изучения CRISPR/Cas, в том числе и о патентных спорах и драмах, проливающих свет на бизнес-составляющую современной науки, однако моя цель – разобрать научную составляющую методов и спектр их применений, а потому вернемся к науке.

Пока что мы изображали систему CRISPR/Cas9 исключительно деструктивной, расщепляющей ДНК в нужном месте. Благодаря этому ее свойству мы можем инактивировать ген. Клетки обладают механизмами выявления и починки повреждений ДНК. Такие системы репарации необходимы прежде всего для устранения дефектов, рутинно возникающих в ходе репликации ДНК, а также под действием побочных продуктов обмена веществ или физических факторов вроде ультрафиолета. Восстановлением ДНК занимаются белки, сшивающие друг с другом концы рассеченных цепей. Но при этом нередко возникают ошибки: нуклеотиды на стыке могут замениться, добавиться или выпасть. Такие ошибки часто приводят к синтезу нефункционального белка.

Природный инструментарий починки ДНК можно использовать и более конструктивно – например, для внедрения в геном новых последовательностей. Мы можем ввести в клетку фрагменты ДНК с любым желательным для нас геном. Ремонтные белки непривередливы: они сшивают любые концы ДНК, которые находят, – и с их помощью один из наших фрагментов может попасть в разрыв цепей и с обеих сторон соединиться с геномом. Возможно, вы уловите в выражении «может попасть» немало неопределенности, и будете правы: вероятностная природа микроскопического мира здесь проявляется сполна. Расщепленные Cas9 свободные концы ДНК перемещаются по законам броуновского движения. Белки, которые выявляют и чинят поврежденную ДНК, тоже блуждают. Какую пару они найдут раньше – свободный конец геномной ДНК и конец введенного в клетку фрагмента либо два свободных конца генома, – зависит от траектории их случайных перемещений, хотя мы и можем влиять на результат введением в клетку множества копий нужного гена, и тогда белок с большей вероятностью наткнется именно на него. Cas9 между тем останется в клетке – он может опять найти свою ДНК-мишень, расщепить ее и повторять процесс снова и снова. У нас есть шанс получить желаемый результат, но нет в этом уверенности. Как и в случае старых методов, нам придется совершить много ошибок, прежде чем мы добьемся успеха. Тем не менее, если все выходит как задумано, этот метод позволяет поместить наш ген ровно в то место генома, где мы хотим его видеть.

Хотя программируемые системы CRISPR/Cas9 появились от силы 10 лет назад, ученые уже изобрели более удобные схемы внедрения генетического материала. Перспективный метод праймированного редактирования, разработанный в 2019 году группой Дэвида Лю из Института Эли и Эдит Броуд, задействует широкий спектр клеточных механизмов²⁶. Я не буду вдаваться в детали, но по сути он сплавляет модифицированный Cas9 с обратной транскриптазой – белком, формирующим ДНК на матрице РНК (см. главу 13), – и включает в РНК-гид ту самую матрицу для внедряемой, измененной по сравнению с геномной последовательности ДНК. Химера из Cas9 и обратной транскриптазы узнает и разрезает в нужном месте одну из цепей геномной ДНК, а затем в месте разреза синтезирует по матрице гидовой РНК новую ДНК, уже с желаемыми изменениями. Лишний фрагмент старой цепи должны отрезать клеточные ферменты. Рисунок дает общее представление об этом многоэтапном процессе[68]: ДНК обозначена черным, РНК – серым, на измененную последовательность указывают стрелки; белок не представлен.

Группа Лю успешно применила праймированное редактирование в клеточных культурах мыши и человека и отметила, что эта техника принципиально пригодна для исправления 89 % генетических вариантов, ассоциированных с болезнями человека. (В оставшиеся 11 % входят, например, множественные копии генов, с которыми не справиться простым переписыванием участка ДНК.)

В этой искусной подгонке ДНК с помощью иголок и ниток – белков и нуклеотидов – находит отражение физическая природа биологических молекул. ДНК – это носитель генетической информации, и чтобы изменить эту информацию, мы создаем инструменты, позволяющие нам без визуального контроля захватывать, разрезать, вставлять и сшивать ДНК-фрагменты. Точность операций поражает даже с небиологической точки зрения. Размеры некоторых деталей новейших компьютерных микросхем не превышают 10 нанометров. Длина одного нуклеотида ДНК составляет около ⅓ нанометра, но его можно контролируемо заменять с помощью праймированного редактирования и других новейших подходов.

Как мы узнали, активность клетки определяется не только физическим присутствием в ней какого-либо гена. Важнейшую роль играет регуляция – контроль разных этапов реализации закодированной в нем информации (см. главу 4). Ученые уже придумали, как использовать CRISPR/Cas9 для программирования регуляторных механизмов. И снова гидовая РНК этой системы служит проводником к геномным мишеням. А вот вместо стандартного белка Cas9 здесь работают его модифицированные формы, не способные расщеплять ДНК. Чтобы отключить целевой ген, лишенный нуклеазной активности Cas9 должен просто сесть в нужном месте на ДНК и помешать работе РНК-полимеразы, как это делает обычный репрессор. Такую технику использует описанный в главе 9 переключатель, который лишает бактерию возможности направленно плыть. Но гены можно и включать – например, привязывая безнуклеазный Cas9 к активаторам транскрипции, которые рекрутируют РНК-полимеразу. Таким образом, благодаря CRISPR у нас появился удобный доступ не только к геномам, но и к их регуляторным схемам.

О томатах, T-лимфоцитах и терапии

Методы на базе CRISPR позволяют легче и изящнее изменять растения, которые тысячи лет служили мишенями генетических манипуляций. Предок помидора, который по-прежнему встречается в дикой природе, дает плоды размером с горошину. В ходе одомашнивания растения его плоды становились крупнее и питательнее – так получились знакомые нам томаты. Избирательное скрещивание позволило нам отобрать предпочтительные генетические варианты, но за традиционную селекцию мы расплачиваемся снижением генетического разнообразия и устойчивости растений к стрессам, характерной для их дикого родственника. В 2018 году ученые применили систему CRISPR/Cas9, чтобы встроить в геном дикого растения всего четыре гена одомашненных томатов²⁷. В результате оно дало плоды массой втрое больше обычной. Точность CRISPR не только бережет целостность генома, но и не допускает переноса потенциально нежелательных сцепленных генов – побочного эффекта традиционной селекции (мы видели похожее сцепление у арбуза).

Но, разумеется, больше всего нас заботит собственный организм. Медицинские подходы на базе генетического редактирования разрабатывают и внедряют с головокружительной быстротой. Эти техники не только приносят пользу, но и проливают свет на тонкости практического применения редактирующих инструментов. Чтобы системы CRISPR/Cas9 могли вырезать и вставлять фрагменты генома, эти молекулярные машины должны попадать внутрь клеток, которые мы хотим модифицировать. Лучше всего с этой задачей справляются вирусы, специально доработанные для переноса ДНК, которая кодирует белок Cas9 и необходимые последовательности РНК. Вирусы автоматически распознают клетки-мишени, прикрепляются к ним и затем проникают внутрь.

Но направить вирусы только в нужные нам клетки очень сложно. Одно из решений – извлекать целевые клетки из организма, редактировать их и помещать обратно. В 2015 году, например, ученые из Пенсильванского университета отбирали клетки крови и циркулирующие иммуноциты у пациентов, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), который атакует T-лимфоциты, и возвращали их уже отредактированными²⁸. Еще раньше ученые заметили, что мутация в гене CCR5, кодирующем мембранный белок Т-лимфоцитов, может защищать от ВИЧ-инфекции[69]. Пенсильванская группа повредила в извлеченных Т-клетках CCR5 и ввела их в кровоток тех же пациентов. Улучшение здоровья после процедуры оказалось незначительным, но метод зарекомендовал себя как безопасный и убедил несколько научных коллективов продолжить разрабатывать это терапевтическое направление. Еще один новаторский эксперимент 2015 года тоже задействовал иммунные клетки, на этот раз взятые у донора: их отредактировали, чтобы сделать устойчивыми к противораковым препаратам, и ввели в организм годовалой девочки, которая страдала лейкозом, не отвечающим на другие методы лечения²⁹. Как правило, донорские иммуноциты провоцируют мощный и потенциально смертельный иммунный ответ у реципиента, если подходят ему не идеально. В этом же эксперименте редактирование предполагало и отключение генов, запускающих такой ответ. Организм ребенка принял модифицированные клетки спокойно, и лейкоз перешел в стадию ремиссии.

Ни в одном из приведенных примеров редактирования не использовали систему CRISPR/Cas9: ученые работали упомянутыми в начале главы инструментами, которые появились немного раньше: ZFN (в случае с ВИЧ) и TALEN (в случае с лейкозом). Сегодня разрабатывается множество методов терапии на базе CRISRP/Cas9. Вместе с тем саму модификацию стараются переносить внутрь человеческого организма, чтобы воздействовать на ткани и органы, которые невозможно извлечь из тела.

В начале 2020 года носитель редкой мутации, вызывающей слепоту, стал первым человеком, в организм которого напрямую – инъекцией вирусов в глаз – ввели систему CRISPR/Cas9³⁰. Мутация, на устранение которой она нацелена, происходит в гене белка, необходимого для построения «башенок», содержащих светочувствительные молекулы, в особых клетках сетчатки[70]. Чтобы гарантировать редактирование гена только в нужных клетках, в молекулу ДНК, кодирующую Cas9, встроили промотор, разрешить считывание с которого могут лишь факторы транскрипции, производимые именно в тех клетках сетчатки. Если проходящее сейчас клиническое исследование окажется успешным, это станет поворотным моментом в истории лечения слепоты, ведь результат теперь будет достигаться не сложной операцией или внедрением электрического имплантата, а подстройкой собственной инструкции человека по самосборке.

CRISPR и анти-CRISRP

Понимание роли биофизических принципов самосборки и регулирования помогает нам постичь механику редактирования генома. Объясняя, как Cas9 находит нужные участки ДНК, я вскользь упомянул и другую тему – случайность. Но случайность даже важнее, и контролировать или хотя бы учитывать ее в практике редактирования геномов – непростая задача. Я сказал, что Cas9 посредством удерживаемого им РНК-гида связывается с последовательностью ДНК, комплементарной гидовой РНК. В целом это так, но только сложнее. Как и в любом молекулярном взаимодействии, сродство максимально при идеальном совпадении, но при неидеальном не падает до нуля. Всегда есть вероятность, что Cas9 атакует неправильную ДНК. Насколько эта вероятность значима, зависит от ее величины и от фактора времени. Допустим, вероятность нецелевого связывания Cas9 составляет 1 к 1000. Какой бы ни была наша задача, вероятность одного промаха на тысячу попаданий приемлема. (Это даст нам, например, лишь несколько аутсайдеров в сетчатке, полной восстановленных клеток.) Но представим дальше, что Cas9 продолжает работать в клетках, синтезируясь с гена доставленной ДНК. Может, за неделю и возникнет одна ошибка, но через 1000 недель (20 лет) белок почти наверняка хоть раз промажет мимо цели во всех клетках. Реальные показатели зависят от особенностей связывания и математики вероятностей. В одних случаях выгода перевешивает риски, в других – нет. Мы могли бы существенно повысить шансы в свою пользу, если бы научились отключать Cas9 сразу после выполнения задачи, а не позволять ему блуждать активным вечно.

Кажется, что в нескончаемой конкурентной борьбе между организмами на каждую уловку у них находится ответная, против каждого оружия есть защита, а на каждую защиту есть оружие, которое эволюционирует, чтобы обойти ее. Пожалуй, неудивительно, что раз существует CRISPR, то существует и анти-CRISPR. Вирусы выработали инструменты, выводящие из строя механизмы бактериального иммунитета. Анти-CRISPR обнаружили в районе 2012 года: магистрант Джо Бонди-Деноми из лаборатории Алана Дэвидсона в Университете Торонто заметил тогда, что некоторым вирусам удается-таки закрепиться в бактериях, обладающих CRISPR-спейсерами против них³¹. Оказалось, что в ходе какого-то из прежних вторжений вирусы успели встроить в бактериальную ДНК гены своих белков, мешающих работе Cas. Систем анти-CRISPR великое множество – нам известно уже больше 50, – и нацелены они на всевозможные компоненты и этапы CRISPR-защиты³². Одни не позволяют белкам Cas объединяться с гидовыми РНК, другие – связываться с ДНК или расщеплять ее, третьи режут РНК-гиды, а механизмы многих пока непонятны. Но в каждом случае ключевыми оказываются биофизические взаимодействия. Например, блокируя связывание с ДНК, некоторые белки анти-CRISPR воспроизводят профиль электрического заряда ДНК: они копируют силовую и пространственную картину ее отрицательно заряженной поверхности, чтобы улечься в связывающую бороздку Cas, то есть занять место, предназначенное для ДНК. Кажется, вирусы используют электрические свойства ДНК в своих целях подобно тому, как мы применяем их для перемещения нуклеиновых кислот в гелях (см. главу 13).

Почти сразу после открытия анти-CRISPR ученые поняли, что новые системы могут сослужить добрую службу в редактировании генома. В 2017 году Дженнифер Даудна и другие ученые, включая Бонди-Деноми (который к тому времени возглавил собственную лабораторию в Калифорнийском университете в Сан-Франциско), показали в человеческих клетках, что введение анти-CRISPR после редактирующей системы на основе Cas9 эффективно подавляет дальнейшую модификацию ДНК, а значит, уменьшает число нежелательных генетических изменений³³.

В последних главах мы рассматривали ДНК с более широкого физического ракурса, чем в первой части книги. Знания о природе этой молекулы и ее взаимодействиях с другими веществами, будь то белки вроде полимераз и Cas9 или неорганические структуры типа полупроводников из главы 13, наделили нас способностью читать и писать на языке генов. В следующей, заключительной, главе я больше расскажу о возможностях, которые предоставляет нам эта способность. Особое внимание я уделю редактированию человеческих геномов и видоизменению экосистем – темам, при обсуждении которых на передний план выходят этические вопросы. А еще я немного поразмышляю над тем, как биофизический ракурс формирует наши представления о мире и какое значение это имеет для решения практических и фундаментальных задач.

Но зачем так изощряться? Пожалуй, самая весомая цель – избавление от малярии. Каждый год от этой болезни умирают более 400 тысяч человек и более 200 миллионов хоть и выживают, но длительно страдают от жара, дрожи, слабости и головных болей¹¹. Малярию вызывает эукариотический паразит, который переносится самками комаров из рода Anopheles (так называемых «малярийных комаров») и передается человеку, когда они пьют его кровь. Сами насекомые получают возбудителя из крови инфицированных людей. Комары переносят и другие тяжелые заболевания – в частности, лихорадки денге, Зика и Западного Нила. Целый ряд государственных ведомств, некоммерческих организаций и органов здравоохранения активно обсуждает возможность применить генный драйв к малярийным комарам. Таким способом их можно сделать устойчивыми к паразитам либо вообще истребить. Для реализации второго сценария можно, например, распространить мутацию, определяющую маскулинность, из-за чего популяция переполнится самцами и не сможет воспроизводиться; а можно повредить гены, связанные с откладкой яиц, и таким образом распространить стерильность.

Хотя лабораторные исследования генных драйвов у комаров дают ожидаемый результат, модифицированных насекомых пока не выпускают в дикую природу. На волю, однако, выпускают других комаров, геном которых корректируют инструментами, не распространяющимися по популяции. Начиная с 2009 года в Бразилии, Малайзии и на Каймановых островах выпустили больше миллиарда комаров мужского пола с генетической вариацией, смертельной для их потомства¹². Биотехнологическая компания Oxitec, создавшая этих комаров, заявила об успехе эксперимента: в пределах опытного участка на Большом Каймане популяция комаров сократилась на 80 %, а в бразильском городе Жакобина – на 90 %¹³. В 2021 году насекомых выпустили на архипелаге Флорида-Кис, где резко выросла заболеваемость лихорадками денге и Зика¹⁴. Разработанный для этого района план в августе 2020-го после ожесточенных споров о новой методике одобрили четырьмя голосами против одного на голосовании в местном Совете по контролю популяции комаров. Традиционно численность этих насекомых здесь контролировали распылением пестицидов, убивающих 30–50 % популяции.

Любопытно, что модифицированные комары Oxitec наглядно демонстрируют работу биофизического механизма, с которым мы уже встречались: летальная мутация находится у них в гене, кодирующем не белок с какой-то узкой биохимической активностью, а фактор транскрипции (см. главу 4), что изменяет регуляторные схемы организма¹⁵. Очевидно, мутантные комары производят активатор, который подстегивает собственное перепроизводство; из-за этой положительной обратной связи непрерывно нарастает производство бесполезного белка, который блокирует клеточные механизмы насекомого. В лаборатории самкам, самцам и их потомкам не дает умереть специальный препарат, подавляющий активность этой регуляторной схемы, но в дикой природе доступа к нему нет. Быстро растущие молодые комары гибнут из-за чрезвычайно высокой чувствительности к регуляторному дисбалансу. Между этим методом и генным драйвом есть как сходства, так и различия. Например, оба метода предполагают изменение генома: первый требует постоянного пополнения популяции модифицированными особями, а второй автоматически обеспечивает передачу изменений в поколениях. Понимать разницу очень важно для принятия информированных решений о том, как работать с насущными проблемами общественного здоровья – например, бороться с инфекциями, распространяемыми насекомыми.

Но вернемся к генным драйвам. Их потенциальное внедрение в дикую природу вызывает беспокойство. Истребление вида, помимо сокращения животного разнообразия планеты, может повредить хищникам или гораздо масштабнее нарушить пищевые цепочки, куда этот вид входит. В случае с малярийными комарами аргументы в пользу генного драйва сильнее, чем во многих других ситуациях, поскольку эти насекомые не составляют основу чьего-то рациона, и даже если бы мы устранили несколько видов комаров, то на планете их осталось бы еще свыше 3 тысяч. К тому же нельзя забывать, что на другой чаше этических весов у нас масса человеческих страданий. И все же вопросов еще много. Например, кто должен решать, применять ли генный драйв? Когда речь идет о комарах и малярии, большинство сходится во мнении, что решения о мерах в Африке, на которую приходится больше 90 % заболеваемости, должны принимать африканцы. Но какие именно? Комары не признают государственных границ, а генный драйв работает везде, где есть его мишени.

Эти решения тесно переплетены с вопросами сохранения окружающей среды. Многим хрупким экосистемам угрожают инвазивные виды. Например, крысы на Галапагосских островах изводят местную фауну, пожирая птичьи и черепашьи яйца. Может, генный драйв в случае крыс стал бы более удачным способом защиты аборигенных видов, чем крысиные яды, которые используют сейчас? Подобные вопросы можно перенести и на другие регионы и виды, включая вредителей сельхозкультур.

Размышления о применении генных драйвов и сходных технологий заставляют нас с тревогой вспоминать все прежние неудачи в инженерии экосистем. И это оправданно. Не увидим ли мы в итоге просто новые версии жабьей эпопеи? Впрочем, мы можем учиться на своих ошибках и утешаться тем, что новые технологии точнее старых. Уже разрабатывают дополнительные меры безопасности вроде закодированных в ДНК механизмов, позволяющих блокировать и даже обращать генные драйвы в популяции¹⁶. В прошлом хирургические операции не отличались изяществом и часто приводили к смерти пациента от инфекции, но сегодня хирургия точна и, как правило, успешна благодаря углублению наших знаний и внедрению новых методов. Я считаю вполне резонным стремление разработать столь же эффективные инструменты для более масштабных вмешательств. Да, это может звучать чересчур оптимистично, но, как я отметил выше, альтернативы современным методам могут быть еще менее приемлемыми.

О взаимоотношениях биотехнологий и общества можно писать еще очень-очень долго. Новые методы и сценарии их применения – воодушевляющие, но рискованные – будут появляться не только в силу углубления наших знаний о природе, но и благодаря дешевизне и удобству создаваемых инструментов. Сегодня я вижу рекламу, в которой мне предлагают полностью прочитать мой геном всего за 300 долларов, тогда как 10 лет назад это стоило 10 тысяч, а 30 лет назад и вовсе 3 миллиарда. Приборы для проведения ПЦР, очистки белков и выращивания клеток сейчас доступны как никогда. Энтузиасты в любительских сообществах делятся биохимическими рецептами и чертежами оборудования, которое печатается на 3D-принтере и помогает осваивать биотехнологическое ремесло прямо в гараже¹⁷. Так, участники проекта «Открытый инсулин» задались целью разработать «доступные каждому организмы для производства инсулина», которые должны подарить диабетикам независимость от коммерческих поставщиков инсулина¹⁸.

Одних подобная доступность биотехнологического инвентаря ужасает, а других, напротив, радует как проявление демократизации науки. Но вне зависимости от нашего отношения факт остается фактом: эти инструменты сегодня повсюду. Технологии, лежащие в основе футуристических сценариев, уже существуют и применяются во множестве не вызывающих беспокойства сфер – например, в диагностике заболеваний или мониторинге микробных загрязнений. Сложно даже представить, чтобы мы отказались от них или перестали искать новые точки их приложения. Я часто использовал здесь местоимение «мы», не уточняя, кого под ним подразумеваю. В контексте биотехнологий «нами», хорошо это или плохо, может быть кто угодно. Любая относительно развитая страна или даже организация способна использовать инструменты, с которыми мы познакомились на этих страницах. Время покажет, как их будут применять. И снова подчеркну, как важно просвещение для того, чтобы мы принимали наилучшие решения, основанные на понимании сути доступных нам технологий, их возможностей и ограничений. Разумеется, ценность просвещенности не сводится к практическим выгодам. В завершение мы вернемся к более глубоким и вдохновляющим урокам, которые преподносит нам изучение механизмов жизни.

Важнейший лейтмотив этой книги – то, что лейтмотивы существуют. Живой мир – это не просто набор анатомических структур и биохимических реакций. Существуют законы, мотивы и механизмы, которые объединяют все компоненты этого мира и их деятельность. Теперь, когда вы прочитали предыдущие 15 глав, это не должно вас удивлять. До сих пор, однако, я избегал вопроса, имеет ли такое единство практическое или скорее эстетическое значение. Этот вопрос повинен в своеобразной напряженности, характерной для множества отраслей современной науки. Сперва я проиллюстрирую этот феномен небиологическим примером, а затем мы вернемся к миру живому.

Нельзя сказать, что к изучению физики меня подтолкнуло одно-единственное переживание, но я до сих пор живо помню, как на уроке физики мы отпускали шарик, который скатывался с горки на стол, а затем падал с края стола в пластиковый стаканчик, стоящий на полу. Нам нужно было предугадать, куда поставить стаканчик, чтобы шарик попал прямо в него. На бумаге это может показаться скучным, но меня не переставало удивлять, что шарик падал точно туда, куда его отправляли универсальные законы движения. Получается, что не нужно запоминать никаких специфических фактов о шариках, горках и стаканчиках, поскольку есть общие лейтмотивы, которыми мы руководствуемся. Физика основана на поиске и применении общих принципов, и таков же фундамент биофизического подхода, который я пропагандирую на страницах этой книги.

Но делать свои предсказания мы могли бы и другим способом – составляя огромную таблицу с результатами экспериментов. Проводя раз за разом один и тот же опыт, мы изменяли бы отдельные параметры: высоту и угол наклона горки, массу и материал шарика, высоту стола, температуру воздуха и прочие потенциально значимые переменные – и записывали бы, куда приземляется шарик. Тогда, зная условия очередного перемещения, мы находили бы его результат в нашей огромной базе данных. На современном научном жаргоне этот прием называется Big Data, «большие данные». Ничего плохого в таком подходе нет, и часто он отлично срабатывает. Мы уже наблюдали это, анализируя корреляции между особенностями генома и, например, ростом человека (см. главу 14). Эти корреляции позволяют нам делать прогнозы, но мы не понимаем, откуда берутся они сами.

Контраст между пониманием базовых принципов и каталогизацией информации все чаще проявляется в большинстве научных сфер, и связано это с повышением эффективности наших инструментов для формирования и обработки массивов данных. В одних случаях, как в стратегиях с использованием броуновского движения, например (см. главу 6), основополагающие закономерности так глубоки и хорошо изучены, что было бы нелепо не принимать их в расчет. В других, как в приведенном выше примере с геномикой, нам пока что остается лишь искать корреляции. А иногда нам вообще непонятно, что делать. В главе 4 мы рассматривали схемы генетической регуляции, состоящие из репрессоров и промоторов, которые управляют активностью генов. Для одних ученых путь вперед означает выявление основных компонентов таких схем – петель обратной связи, осцилляторов, часов и так далее. Для других это не имеет значения: им полезнее учитывать детали всех взаимодействий между всеми компонентами регуляторной сети, даже если их сотни или тысячи. Нельзя сказать определенно, какой из подходов лучше – первый, больше биофизический, или второй, больше феноменологический, описательный. Они не исключают друг друга, и, возможно, в идеале стоило бы применять их параллельно, особенно когда построение подробных моделей помогает нам выявить пока еще неизвестные принципы. И все же напряженность между этими философиями существует и специфически окрашивает дебаты о финансировании и направлениях исследований.

Лично я склоняюсь к тому, чтобы подсвечивать минимальный, базовый набор принципов. В конце концов, гигантская база данных по траекториям падения шарика позволит нам прогнозировать результаты всех будущих экспериментов такого рода, но лишь глубокое понимание законов Ньютона позволило нам вычислить траектории, чтобы отправить людей на Луну. Следовательно, практичность метода может зависеть от временны́х рамок: будем ли мы его применять в решении какой-то из насущных задач или же одной из задач будущего, которые пока непредставимы. Понимание не только практично, но и глубоко притягательно для человека. Пониманию сложно дать определение. И все же человечество испокон веков извлекает из сложности простые, но действенные объяснения, подпитывающие и мифы, и науку.

Возможно, у вас были вполне определенные ожидания относительно концовки этой книги. Мы начали с ингредиентов жизни, молекул и механизмов, создающих внутреннюю динамику клеток. Затем мы рассмотрели сообщества клеток, такие как органы и эмбрионы, а дальше – некоторые принципы, руководящие формообразованием в больших масштабах. Наконец, мы вернулись к субклеточному миру и узнали, как читать и писать на языке генома. Вам могло показаться, что круг замкнулся и мы можем завершить рассказ описанием конструирования организмов – скажем, устойчивых к засухе растений с высокой пищевой ценностью или давным-давно истребленных животных – путем создания и реализации той наследственной информации, которая даст организмам тела и поведение на наш вкус. Можно было бы набросать, например, план трансформации крошечного дикдика в массивного гну. Нам пришлось бы внимательно изучить подсказки в его ДНК, подтолкнуть нуклеотидные последовательности соответствующих генов к формированию новых аминокислотных цепочек, которые укладываются в новые петли и листы, а также руководить экспрессией уймы прочих генов, чтобы формировать кости и мышцы, легкие и глаза с учетом силы притяжения, параметров вдыхаемого воздуха и невесть каких еще требований окружающей среды.

Мы, однако, не знаем, как спроектировать такую трансформацию, поэтому концовка у книги будет другой. Наше незнание вовсе не признак провала, оно говорит нам лишь то, что история, которую мы разбираем здесь, еще далека от завершения. Мы уже знаем основные компоненты и принципы построения жизни. Наше представление о контекстах, в которых они проявляются, пока еще туманно, но постепенно проясняется. Такое впечатление, что мы только-только научились читать и планируем теперь осилить целую библиотеку. Нет гарантии, что мы сумеем во всем этом разобраться. Хотя лейтмотивы и ясны, возможно, будет сложно в полной мере, до мельчайших деталей, понять генетические взаимодействия, химические реакции и микроскопические силы, которые выращивают в одних случаях бук, а в других – бамбук, отличают лошадь от гиппопотама и задают верное соотношение диаметра и длины бедренной кости. Возможно, мы даже признаем это нецелесообразным. Время покажет. Но даже такой исход не уменьшит ценности того, что мы узнали об архитектуре жизни, и не охладит наш энтузиазм к продолжению исследований.

Фундаментальная тяга человека к знанию, поиску связей между феноменами и радости от их установления служит главной мотивацией к исследованию природы. В последних главах мы особенно много говорили о технологических выражениях наших новых представлений об устройстве жизни. Значимость технологий и их пересечений со здоровьем, болезнями и обществом сложно переоценить, и многие люди считают их самой важной из граней науки. Но я все равно решил бы заниматься биофизикой и все равно написал бы эту книгу, даже если бы не было у науки тех самых выражений. Живой мир потрясает разнообразием форм и активностей. В наших дворах и городских парках белки прыгают с ветки на ветку, солнечный свет бликует на прозрачных крыльях стрекоз, а деревья качают углерод из воздуха, чтобы возводить стволы высотой в десятки метров. А есть ведь еще и более экзотические места. Там львы охотятся в саваннах, дельфины резвятся в волнах и рыбы во тьме океанских глубин вырабатывают свет. Мы можем наблюдать за этим и восхищаться красотой.

Теперь мы можем восхищаться еще и тем, что в организме льва скрываются километры ДНК, и тем, как его нейромедиаторы пускаются в пляс всякий раз, когда лев решает атаковать, и уж точно тем, как моторные белки маршируют по скелетам его клеток, – целыми пластами феноменов, столь же примечательных, как и лежащие на поверхности. Кроме того, перед нами теперь со всей очевидностью предстало единство всех организмов, включая наш, – единство, о котором наши предки и мечтать не могли. Сухопутные и морские, новорожденные и взрослые, микроскопические и гигантские – все организмы состоят из одинаковых молекулярных кирпичиков, из немногих типов молекул, которые кодируют информацию и самостоятельно принимают трехмерные формы. Каждый организм становится таким, какой он есть, под влиянием физических сил вселенной: кости львицы и антилопы, которую она выслеживает, формируются с учетом силы притяжения, а дельфин может быть дельфином лишь в просторном жидком доме. Каждый организм не только мирится с микроскопическим хаосом беспокойных молекул, но и преобразует этот хаос в расчет, регулируя активность генов, белков, клеток и органов в ответ на внутренние и внешние стимулы. За внешними проявлениями, какими бы изумительными они ни были, скрывается изящная глубинная основа, которая определяет устройство жизни и которую мы теперь начинаем ценить по достоинству.